分化型甲状腺癌神经内分泌分化与131I治疗疗效的关系

吴凡 李林法 程国平 戴五敏 易贺庆

甲状腺癌是常见的内分泌系统恶性肿瘤[1]，其中分化型甲状腺癌（differentiated thyroid cancer，DTC）占90%以上[2]，包括乳头状甲状腺癌（papillary thyroid cancer，PTC）及滤泡状甲状腺癌（follicle thyroid cancer，FTC）。131I治疗可以降低DTC患者术后复发风险、延长患者生存时间，是DTC术后治疗的重要手段之一。甲状腺癌组织能较好摄碘是131I治疗有效的前提，但有部分患者病灶失去摄碘能力而对131I治疗抵抗，导致治疗效果不理想[3]。神经内分泌分化（neuroendocrine differentiation，NED）存在于各种恶性肿瘤中，如前列腺癌、乳腺癌、胃癌等，在各种腺癌中的检出率为16%～75%。发生NED的肿瘤细胞可在转录因子的调控下通过自分泌、旁分泌等途径刺激周围肿瘤细胞生长及增殖，降低凋亡能力，导致预后不良，但关于其在DTC的131I治疗过程是否发挥作用的相关报道较少。因此，笔者通过免疫组化法分析NED标志性蛋白嗜铬粒蛋白A（chromograninA，CgA）、神经细胞黏附分子1（neural cell adhesion molecule 1，CD56）、突触蛋白（synaptophysin，Syn）和碘代谢关键基因促甲状腺激素受体（thyroid stimulating hormone receptor，TSHR）、钠碘同向转运体（sodium iodide symporter，NIS）在DTC组织中的表达情况，探讨DTC的NED与131I治疗疗效的关系，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 收集中国科学院大学附属肿瘤医院（浙江省肿瘤医院）生物样本库中46例1991年3月至2017年5月接受手术治疗的肺转移DTC患者的病变甲状腺组织石蜡标本，确诊时年龄范围为23～83岁，中位年龄为45岁，其中PTC 39例，FTC 7例，女27例（58.6%），＜55岁34例（73.9%）。根据病历记录人口学数据、病理特征（包括单双侧、远处转移等）和临床结果及第8届美国癌症联合委员会（AJCC）建议评估DTC患者的TNM分期。

1.2131I治疗及疗效判定131I治疗主要通过131I释放β射线破坏残余甲状腺癌组织以降低甲状腺癌转移及复发的概率。病灶是否摄碘由2位核医学科副主任医师根据碘扫图像作出评价，病灶摄碘率=摄碘患者例数/总例数。131I治疗后6个月测定甲状腺激素抑制状态下的血清球蛋白水平，治疗后6～12个月进行胸部CT检查[4]，由2位影像科副主任医师作出诊断。血清球蛋白水平持续下降25%以上，并按照实体瘤的疗效评价标准（RECIST）胸部CT检查显示转移灶缩小、减少则提示131I治疗有效[5]，131I治疗有效率=有效患者例数/总例数。

1.3 标本采集及检测 46例DTC组织分别由2位病理科副主任医师通过HE染色独立作出诊断并选择有代表性的区域。作3μm厚切片，采用免疫组化Envision二步法检测TSHR、NIS、CgA、CD56、Syn的表达。切片常规脱蜡，然后二甲苯脱蜡，并在不同浓度的乙醇稀释液中进行水合；在pH 6.0的柠檬酸缓冲液中微波预处理15 min进行抗原恢复，再用5%H2O2处理切片5 min以阻断内源性过氧化物酶的活性，然后将切片与CgA（美国Invitrogen公司，MA1-25038）、CD56（美国Invitrogen公司，MA5-11563）、Syn（美国Abcam公司，ab32127）、TSHR（美国Abcam公司，ab218108）、NIS（美国Abcam公司，ab242007）抗体（1：100稀释）在室温下孵育1 h；用PBS洗涤3次后，加入二抗（美国Santa Cruz公司，羊抗鼠sc-2005，鼠抗兔sc-2357，1：2 000稀释）在室温下孵育20 min。所有切片用DAB显色5 min，然后用苏木素复染，并由2位病理科副主任医师复查。

1.4 结果判定 根据免疫组化染色强度和阳性细胞百分率评估TSHR、NIS、CgA、CD56、Syn的半定量表达水平。未染色、浅黄、黄棕色和棕色的染色强度评分分别为0、1、2和3。阳性细胞百分率分别为0%、1%～25%、26%～50%、51%～75%和＞75%，评分分别为0、1、2、3和4。将染色强度评分和阳性细胞百分率评分乘积代表CgA、CD56、Syn、TSHR、NIS的半定量表达水平，＜4分为阴性表达，≥4分为阳性表达[6]。

1.5 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。计数资料的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 相关基因表达与临床特征的关系 46例患者中131I治疗有效率为36.9%（17/46），病灶摄碘率为60.8%（28/46）。NIS、TSHR、CgA、CD56在DTC中的阳性表达率 分 别 为28.2%（13/46）、15.2%（7/46）、8.6%（4/46）、15.2%（7/46）。Syn无阳性表达。CgA、CD56表达水平在不同年龄、性别、单双侧、分期、远处转移及疗效的DTC患者之间差异均无统计学意义（均P＞0.05）；NIS表达水平在不同年龄DTC患者之间的差异有统计学意义（P＜0.05），而在不同性别、单双侧、分期、远处转移、摄碘率及疗效的DTC患者之间差异均无统计学意义（均P＞0.05）；TSHR表达水平在不同性别DTC患者之间差异有统计学意义（P＜0.05），而在不同年龄、单双侧、分期、远处转移、摄碘率及疗效的DTC患者之间差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

表1 相关基因表达与临床特征的关系（例）

2.2 CgA、CD56表达与NIS、TSHR表达的关系 CgA与TSHR、NIS表达之间差异无统计学意义（P＞0.05）。CD56阳性患者中NIS阳性率为38.5%（5/13），高于CD56阴性的6.9%（2/29），差异有统计学意义（P＜0.05），而CD56阳性与阴性患者TSHR表达率的差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 CgA、CD56表达与NIS、TSHR表达的关系（例）

3 讨论

目前甲状腺癌的DTC发病率较高，经过手术、甲状腺激素抑制治疗及131I治疗后大部分患者预后良好[7]。本研究中大部分患者病灶能够摄取131I，并且大部分摄碘患者疗效较好，与相关报道相符[8]。但部分患者存在远处转移且不可手术切除的病灶对131I治疗抵抗，患者预后不良，相关机制仍需要进一步的研究[9]。肿瘤进展过程中组织存在NED，将对常规的放化疗等治疗手段产生抵抗。已有研究证明肺癌及前列腺癌存在NED并与患者的放化疗疗效和预后之间有统计学差异[10-11]，而DTC中是否存在NED鲜有文献报道。

评价是否存在NED的基因主要有Syn、CgA、CD56。Syn是与突触结构和功能密切相关的膜蛋白，在神经内分泌细胞中Syn可作为一种非特异的神经内分泌标志物[12]；CgA是一种位于嗜铬性颗粒内的亲水性分泌蛋白，是良好的肿瘤进展标志物，具有调节机体神经内分泌免疫网络的功能[13]；CD56是一种表达于甲状腺滤泡上皮细胞和肾上腺的同型膜糖蛋白，属免疫球蛋白超家族成员，在神经系统中发挥重要作用，与多种肿瘤的进展和转移相关[14]，在肿瘤细胞发育和分化过程中参与细胞与细胞之间的相互作用以及细胞与基质之间的相互作用，调控细胞的迁移。因此本研究将纳入分析CgA、CD56、Syn作为NED标志物在病理组织中的表达情况，其中任何一个阳性即认为有NED特征。本研究中CgA、CD56、TSHR、NIS在甲状腺癌中均有阳性表达，Syn无阳性表达。

NIS和TSHR是参与甲状腺碘代谢的重要蛋白。DTC术后甲状腺激素抑制治疗及131I治疗的理论依据均与NIS和TSHR的表达有关。TSHR是促甲状腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）的受体，其将TSH刺激信号传递到甲状腺上皮细胞内，启动NIS等碘代谢基因的表达，促进甲状腺滤泡上皮细胞摄取碘并完成甲状腺激素的合成，对细胞的碘代谢具有重要意义[15]。DTC保留了甲状腺滤泡上皮细胞对碘的代谢功能，病灶可特异性浓聚碘，因此给予患者发射β射线的放射性131I可以达到治疗转移灶的作用。TSHR和NIS的表达对患者病灶是否摄碘及疗效有重要意义。相关研究表明，DTC中NIS表达降低且在细胞质和细胞膜的定位与BRAFV600E突变有关，与性别、年龄、肿块大小、分期等临床特征均无关[16]。TSHR表达与肿块大小有关，与其它临床特征均无关。本研究表明，不同性别患者中TSHR表达的差异有统计学意义，其它临床特征的差异均无统计学意义；NIS的表达与年龄差异有统计学意义，与其它临床特征的差异均无统计学意义。本研究中CgA、CD56的表达与临床特征均无统计学意义，相关研究在国内外鲜有报道。

由于NED基因是否影响TSHR和NIS表达的研究较少。因此，本研究统计分析CgA、CD56、Syn表达与TSHR和NIS表达之间的关系。NIS表达是决定131I治疗疗效的关键因素，结果显示CD56表达与NIS表达之间差异有统计学意义。有研究显示CD56在正常甲状腺、PTC、滤泡性腺瘤中都有不同程度的表达，但在PTC癌组织中表达阳性率低于癌旁组织[17]。

综上所述，131I治疗可以使部分肺转移DTC患者获益，是DTC术后治疗的重要手段。部分DTC组织存在NED，其中CD56表达与NIS表达之间差异有统计学意义。因此，CD56可能对NIS的表达发挥作用，相关机制需进一步研究。由于组织样本病例数目有限以及免疫组化评价方法的局限，研究结果仍然需要进一步的研究确认。