血浆miR-127-3p及miR-129-5p分子与狼疮性肾炎微观血瘀证的相关性探讨

张绍杰， 汤水福， 涂晓， 钱飞婷， 胡芳玉

（1.杭州市丁桥医院肾病科，浙江杭州 310021；2.广州中医药大学第一附属医院肾病科，广东广州 510405；3.杭州市中医院，浙江杭州 310007；4.绍兴市中医院肾病科，浙江绍兴 312000）

狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）是系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）的肾脏损害，肾活检显示肾脏受累几乎为100%。LN是继发性肾小球肾炎的最常见原因，约占60%[1]。本病治疗较为困难，且易复发。LN 除引起肾小球的病变外，尚可引起肾小管间质病变。有报道LN 中肾小管间质病变可达6.9%～86.5%[2]。我们前期的研究发现，Ⅳ型LN 患者合并肾间质病变达62.5%，且与血瘀证密切相关[3]。

肾小管萎缩及肾间质纤维化等病理改变符合中医学的血瘀证表现，王永钧教授提出对肾脏疾病血瘀证的辨证应宏观与微观、临床与病理相结合，认为肾小球毛细血管微血栓形成、肾小球硬化、肾小管萎缩及间质纤维化等均属于微观意义上的血瘀证[4]。这其中很大一部分患者并无肌肤甲错、舌质紫暗等外在瘀血征象。出现上述病理表现后则治疗较为棘手，且效果欠佳。若能早期诊断微观血瘀证，及时加以干预，则可在一定程度上延缓病情进展。故在此围绕LN 微观血瘀证，选取miR-127-3p、miR-129-5p及相关实验室指标进行对照研究，以期能对微观血瘀证的辨证提供简便客观的指标，以利于临床上的早期诊断及干预。现将研究结果报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象及分组收集2018年6月至2020年1月在杭州市中医院住院治疗的LN患者，共60例，其中微观血瘀证组与非血瘀证组各30例。所有患者均已于本院或外院行肾穿刺活检，具有明确的病理结果。同时，选取15例健康志愿者作为健康对照组。

1.2 病例选择标准

1.2.1 诊断标准 西医诊断标准：参照1997年美国风湿病协会制定的SLE 诊断标准，符合4 项或4 项以上者即可诊断为SLE，其中包含第7 项者即可诊断为LN。中医微观血瘀证诊断标准：参照王永钧教授《IgAN 肾病理的中医微观辨证》[4]中的瘀痹证标准制定。①死血凝着：肾小球毛细血管内微血栓形成，毛细血管内血栓样物质沉积，肾小静脉血栓，毛细血管闭塞、淤血。②肾内微癥积：肾小球局灶、节段硬化，肾小管萎缩，间质纤维化，纤维性新月体，球周纤维化。符合上述病理表现任意一项者即可辨为微观血瘀证。

1.2.2 纳入标准 ①符合上述西医LN 的诊断标准；②符合上述中医微观血瘀证诊断标准；③临床资料完善的患者。

1.2.3 排除标准 ①合并有高血压、糖尿病等其他能引起肾脏损伤的疾病患者；②患有混合性结缔组织病的患者；③患有尿路感染等感染性疾病的患者；④合并有心、脑、肝和造血系统等严重原发性疾病的患者；⑤临床资料不完善的患者。

1.3 观察指标

1.3.1 miR-127-3p、miR-129-5p分子表达情况 所有受试者均空腹抽取静脉血8 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，以4 000 r/min（离心半径为13.5 cm）离心10 min，分离血浆，并于-80 ℃保存。委托广州维伯鑫生物科技股份有限公司完成血浆miR-127-3p、miR-129-5p 分子的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测。

1.3.2 肾病理指数 包括活动性指数（AI）和慢性化指数（CI），均采用Austin 半定量法判定，其中AI为0～24分，CI为0～12分。

1.3.3 肾功能指标 检测LN患者血尿素氮（BUN）、血尿酸（UA）、血肌酐（Cr）、血清胱抑素（Cys-C）等肾功能指标。

1.4 统计方法应用SPSS 17.0统计软件进行数据的统计分析。计量资料用均数 ± 标准差（）表示，符合正态分布者采用t检验，非正态分布者采用秩和检验；计数资料用率或构成比表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman 秩相关系数检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患者的基线资料比较表1 结果显示：2组患者的性别、年龄等基线资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

表1 2组狼疮性肾炎（LN）患者的性别和年龄比较Table 1 Comparison of the gender and age of LN patients between the two groups（）

表1 2组狼疮性肾炎（LN）患者的性别和年龄比较Table 1 Comparison of the gender and age of LN patients between the two groups（）

组别微观血瘀证组非血瘀证组F/t值P值例数（例）30 30性别[男/女（例）]5/25 1/29 2.963 0.195平均年龄（岁）42.76±15.98 42.50±13.71 0.195 0.846

2.2 2组患者的肾功能指标比较表2 结果显示：微观血瘀证组患者的BUN、UA、Cr 和Cys-C 水平均明显高于非血瘀证组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表2 2组狼疮性肾炎（LN）患者肾功能指标比较Table 2 Comparison of renal function indexes between the two groups of LN patients （）

表2 2组狼疮性肾炎（LN）患者肾功能指标比较Table 2 Comparison of renal function indexes between the two groups of LN patients （）

①P＜0.05，与非血瘀证组比较

组别微观血瘀证组非血瘀证组Cys-C（mg·L-1）2.13±1.18①0.99±0.28例数（例）30 30 BUN（mmol·L-1）12.75±8.56①5.42±4.02 UA（μmol·L-1）403.93±102.43①308.70±94.17 Cr（μmol·L-1）182.97±161.12①58.53±27.29

2.3 2组患者的肾病理指数比较表3 结果显示：微观血瘀证组患者的AI 和CI 水平均明显高于非血瘀证组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表3 2组狼疮性肾炎（LN）患者肾病理指数比较Table 3 Comparison of renal pathological indexes of LN patients between the two groups（）

表3 2组狼疮性肾炎（LN）患者肾病理指数比较Table 3 Comparison of renal pathological indexes of LN patients between the two groups（）

①P＜0.05，与非血瘀证组比较

组别微观血瘀证组非血瘀证组慢性化指数（CI）4.05±2.26①2.53±21.65例数（例）30 30活动性指数（AI）8.32±4.20①5.53±4.51

2.4 2组患者miRNA 分子表达量比较表4 结果显示：在miR-127-3p 分子的表达方面，微观血瘀证组的miR-127-3p 分子表达量明显高于非血瘀证组及健康对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；而非血瘀证组与健康对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。在miR-129-5p 分子的表达方面，微观血瘀证组的miR-129-5p 分子表达量明显高于非血瘀证组（P＜0.05）；而微观血瘀证组、非血瘀证组与健康对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表4 2组狼疮性肾炎（LN）患者miR-127-3p、miR-129-5p分子表达量比较Table 4 Comparison of miR-127-3p and miR-129-5p molecular expression levels between the two groups of LN patients （）

表4 2组狼疮性肾炎（LN）患者miR-127-3p、miR-129-5p分子表达量比较Table 4 Comparison of miR-127-3p and miR-129-5p molecular expression levels between the two groups of LN patients （）

①P＜0.05，与非血瘀证组比较；②P＜0.05，与健康对照组比较

miR-129-5p 1.85±1.09①0.81±0.66 1.53±2.10组别微观血瘀证组非血瘀证组健康对照组例数（例）30 30 15 miR-127-3p 7.38± 3.76①②1.73±2.13 1.27±1.23

2.5 相关性分析经Spearman 秩相关分析，60例狼疮性肾炎患者miR-127-3p表达量与血Cr、BUN、UA、Cys-C 水平呈显著正相关（r=0.541，P=0.00；r=0.490，P=0.000；r=0.490，P=0.004；r=0.367，P=0.003）。miR-129-5p表达量与血Cr、BUN 水平呈显 著 正 相 关（r=0.408，P=0.001；r=0.339，P=0.008），而与血UA、Cys-C 水平无明显相关性（r=0.194，P=0.138；r=0.265，P=0.068）。miR-127-3p 表达量与AI 呈显著正相关（r=0.307，P=0.048），而与 CI 无明显相关性（r=0.172，P=0.276）。miR-129-5p 表达量与AI、CI 均无明显相关性（r=0.267，P=0.087；r=0.145，P=0.359）。

3 讨论

狼疮性肾炎（LN）患者很大一部分合并肾小管间质病变，而此病理改变是促使LN 进入终末期肾病的最大危险因素[5]。我们前期研究数据证实此种病理改变与血瘀证密切相关，也就是说出现血瘀证后预后一般较差，尤其是出现肾小管萎缩及间质纤维化等较严重的改变，此时治疗虽有一定效果，但难以逆转，很快便进展至终末期肾病，若能早期加以干预，或可延缓病情进展。肾穿刺活检不能反复进行，故需探索简单易行的客观指标来辅助诊断微观血瘀证。

本研究结果显示，LN 微观血瘀证患者Cr、BUN、UA、Cys-C 水平均明显高于非血瘀证患者。从现代医学角度来看，Cr、BUN、UA、Cys-C 等指标均反映肾功能程度，微观血瘀证患者病理表现为肾组织硬化、纤维化、萎缩等，这均是病情加重的表现，所以肾功能程度要比非血瘀证组差。从中医方面来讲，瘀血痹阻肾络，肾失泄浊，久之浊毒内留，故血肌酐、尿素氮等毒素蓄积体内而导致这些肾功能指标升高。陈丽贞等[6]研究也证实，LN 合并血瘀证的患者肾功能指标要显著高于未合并血瘀证患者，这与我们的研究结果相符合。对血瘀证患者加以中药干预可取得一定的效果。胥晓芳等[7]研究证实，活血化瘀中药治疗可改善慢性肾脏病患者肾小管间质损伤程度，从而能够起到保护肾小管功能的作用。

慢性化指数（CI）能反映肾脏的慢性损害程度，肾小球硬化、纤维性新月体形成、肾小管萎缩、间质纤维化等病理表现均属于微观血瘀证的范畴，故其CI显著增高。这与我们前期研究结果相符合，研究证实传统意义上的血瘀证LN 患者CI也显著增高，并认为血瘀证与CI具有一定相关性[3]。活动性指数（AI）能反映肾脏活动性病变的程度，其水平越高，说明微观血瘀证组患者疾病活动性越强，需要更为积极的治疗来控制病情活动。若治疗不及时或治疗强度不足，活动性病变未有效控制，逐渐演变为硬化、纤维化等病理改变，进而导致CI水平的进一步升高。

LN 微观血瘀证患者miR-127-3p、miR-129-5p 分子表达量显著高于非血瘀证患者，且二者与部分肾功能指标具有正相关性。通过与健康对照组比较，可以排除LN 疾病本身导致的2 个分子表达量改变，说明二者与微观血瘀证具有一定相关性，并能在一定程度上反映肾功能情况。已有研究证明miR-127 分子能起到保护肾小管功能的作用[8]；同时又有研究[9]表明，百令胶囊可能通过调控miR-127 的表达而达到缓解LN 病情的目的。这说明miR-127 分子在肾脏疾病中具有重要作用。Li C 等[10]研究发现，miR-129 能参与小鼠肾脏纤维化的发生发展。Wang Q 等[11]研究发现，miR-129等分子能促进糖尿病肾病小鼠肾脏纤维连接蛋白的合成，最终导致纤维化的发生。肾脏纤维化属于微观血瘀证范畴，这也从侧面说明miR-129 分子与微观血瘀证密切相关。miR-127-3p 表达量与AI 具有显著正相关，说明该分子可直接反映肾脏病理活动性情况。本研究显示2 个分子与CI 并无直接相关性，但并不能说明二者与肾脏慢性化病变无关，毕竟二者在微观血瘀证组中的表达是显著增高的，不排除由于本研究样本量少，可能存在偏倚等情况，而且并没有对肾脏病理改变情况进行细致的评估，故确切的结论有待今后更深入的研究加以证实。

miRNA 除存在于组织外，也存在于血液、尿液、唾液等体液中，这更方便临床采集标本，实用性较好。且miRNA 比较稳定，有研究发现标本在室温存放1周或反复冻融后，miRNA的变化很轻微[12]。由此可见，miRNA 分子是较理想的研究指标。本研究的2 个miRNA 分子已证实与微观血瘀证具有一定相关性，加之检测方便、稳定，具有作为特异性标志物的潜力，但还需后期进一步的研究来证实。