叶酸代谢通路基因在肝癌中的表达及意义

孙文文 张凌云

原发性肝癌是最常见的恶性消化道肿瘤之一，其中最主要的组织学类型的是肝细胞癌。肝脏是人体最重要的消化器官之一，是包括糖类、蛋白质、维生素等物质的代谢场所。叶酸是一种人体必需的B族维生素，它在人体中经过转化变成四氢叶酸，而四氢叶酸能够携带一碳单位参与核苷酸和脱氧核苷核酸的合成，可见叶酸在保持基因组稳定方面具有重要作用。分析叶酸代谢通路发现，甲硫氨酸合成酶(MTR)、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、亚甲基四氢叶酸脱氢酶1(MTHFD1)、MTHFD2、线粒体系氨酸羟基甲基转移酶1(SHMT1)和SHMT2在叶酸代谢中起着重要的作用。本研究主要通过生物信息学分析的方法，分析上述6种叶酸代谢通路的关键基因在肝癌组织中的表达数据，研究其与临床预后、免疫调控之间的关系，为进一步研究叶酸代谢在肝癌的发生发展及预后中的意义提供理论依据。

资料与方法

一、在线数据库基因表达水平分析

Oncomine数据库(www.oncomine.org)和基因表达谱分析(GEPIA，http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)对叶酸代谢通路的关键基因在人肝癌组织及正常肝组织中的mRNA表达水平进行分析比较。以P<0.05、差异倍数>1.5倍为差异有统计学意义。

二、GEPIA预后分析

采用在线工具Kaplan-Meier生存曲线(www.kmplot.com)和GEPIA评估叶酸代谢通路关键基因mRNA表达的预后价值。

二、基因改变频率分析

采用cBioPortal数据库(http://www.cbioportal.org)分析肝癌患者中叶酸代谢通路关键基因改变的情况。

三、生物信息学分析

STRING(https://string-db.org/)和GeneMANIA(http://www.genemania.org)中分析叶酸代谢通路关键基因与其他基因或蛋白间的互作关系。

四、免疫浸润细胞的相关性分析

TIMER(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)数据库中分析叶酸代谢通路关键基因在肝癌中与免疫细胞的相关性。

结 果

一、叶酸代谢通路相关基因在肝癌组织中的表达

采用Oncomine数据库分析叶酸代谢通路关键基因(MTR、MTHFR、MTHFD1、MTHFD2、SHMT1和SHMT2)在人肝癌组织与正常肝组织中的表达。在肝癌组织中MTR的mRNA表达水平是肝脏正常组织的2倍，肝癌组织中MTHFD2的mRNA表达水平是肝脏正常组织的1.6倍，差异均有统计学意义(图1A)。通过GEPIA数据库对这些基因进行分析，其表达趋势与Oncomine数据库中的数据基本一致，但差异无统计学意义(图1B)。

图1 叶酸代谢关键基因在Oncomines和GEPIA数据库中的表达

二、叶酸代谢通路关键基因的改变

cBioPortal数据库中分析肝癌中叶酸代谢关键基因的改变，结果显示基因改变主要包括基因扩增、缺失突变和错义突变。MTR、MTHFR、MTHFD1、SHMT1和SHMT2均存在基因扩增改变，基因缺失突变也是MTHFR和SHMT1常出现的基因变异，其中MTR中存在8%的基因突变。除SHMT1外，这些叶酸代谢基因均存在不同程度的错义突变(图2)

三、叶酸代谢通路关键基因在肝癌预后中的价值

Kaplan-Meier生存分析显示，MTHFR的高表达与肝癌预后不良相关(HR=1.49，P=0.04)；而MTHFD1和SHMT1的高表达则表示肝癌患者的预后良好(HR=0.63，P=0.008 9和HR=0.52，P=0.000 31；图3A)。MTHFD2和SHMT1的高表达均与肝癌患者的无病进展期呈正相关(HR=0.72，P=0.028和HR=0.53，P=1.9e-05；图3B)。在进一步对叶酸代谢基因与肝癌患者不同病理分期相关性分析中，发现SHMT1与肝癌患者临床分期相关，其表达水平在不同的肝癌分期中差异有统计学意义(P=0.000 415；图3C)，而其他基因差异无统计学意义。

四、叶酸代谢通路关键基因的互作图

在STRING(图4A)和GeneMANIA(图4B)数据库中分析叶酸代谢通路基因之间的相互作用关联图，可见除了各基因之间相互作用外，还与其他很多基因存在关联。在两个数据库的分析结果中均发现叶酸代谢通路关键基因与ATIC基因存在相互作用。

图2 叶酸代谢关键基因在肝癌中的基因改变

A：总生存期；B：无疾病进展期；C：临床分期图3 叶酸代谢关键基因表达与肝癌患者临床资料的相关性分析

图4 叶酸代谢通路关键基因的分子互作图

五、叶酸代谢通路与机体免疫系统的关系

肝癌是一种与机体免疫系统息息相关的恶性肿瘤，通过TIMER数据库分析了叶酸代谢通路与机体免疫的关系。MTHFR在肝癌中的表达与B细胞(Cor=0.1558,P=4.02e-03)、CD8+T淋巴细胞(Cor=0.121,P=2.58e-02)、CD4+T淋巴细胞(Cor=0.343,P=6.44e-11)、巨噬细胞(Cor=0.302,P=1.32e-08)、中性粒细胞(Cor=0.371,P=1.04e-12)和树突状细胞(Cor=0.317,P=2.25e-09)的浸润呈正相关；MTHFD2的表达与B细胞(Cor=0.466,P=6.06e-20)、CD8+T淋巴细胞(Cor=0.515,P=1.34e-24)、CD4+T淋巴细胞(Cor=0.501,P=2.66e-23)、巨噬细胞(Cor=0.608,P=7.33e-36)、中性粒细胞(Cor=0.513,P=1.41e-24)和树突状细胞(Cor=0.672,P=4.64e-46)的浸润也呈正相关(P<0.05)但并未发现其他叶酸代谢通路基因与机体免疫浸润细胞之间的相关性(图5)。

讨 论

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，在全球癌症致死率中位于第五位[1]，在中国的癌症致死率中位于第四位[2]。叶酸为DNA合成提供嘌呤和胸苷，有研究显示叶酸缺乏或代谢障碍与肝癌发病风险增高相关[3]。肝脏本身是储存叶酸的主要器官，所以叶酸代谢通路的异常更有可能与肝癌的发生发展密切相关。本文主要对叶酸代谢通路的关键基因(MTR、MTHFR、MTHFD1、MTHFD2、SHMT1和SHMT2)在肝癌中的表达、基因突变类型以及对肝癌患者预后、免疫相关性等方面进行研究。

MTR是体内唯一能转化5-甲基四氢叶酸的酶，有研究显示MTR基因的错义突变可从翻译水平抑制MTR的表达[4]，导致MTR表达量的降低，造成DNA的低甲基化，参与肝癌的发生发展。本研究发现，在肝癌中MTR基因的改变主要为基因扩增和错义突变，而其表达量与肝癌患者的总生存期、无疾病进展期等并无显著相关性。通过这些数据可以推断出MTR在肝癌发生发展中的作用可能与该基因的功能缺失有关，其表达量的增加可能并不会对肝癌细胞生物学行为产生影响。

MTHFR基因突变是引起该酶活性缺乏和降低的主要机制[5,6]。本研究发现肝癌中MTHFR基因的改变主要为缺失突变，且肝癌组织中MTHFR的相对低表达与肝癌患者的生存期延长存在显著相关性。另外，MTHFR与多种免疫细胞浸润存在显著相关性，如T细胞、B细胞、巨噬细胞等，说明MTHFR与肝癌患者的免疫微环境调控相关，也说明叶酸代谢通路在某种层面上参与机体免疫系统的调控。

有数据表明，MTHFD2蛋白在肝细胞癌组织中高表达[7]，这与本研究数据一致。但也有研究显示癌组织中MTHFD1[8]和MTHFD2[7]的高表达与肝癌患者的预后呈负相关。本研究通过生物信息学分析的数据显示MTHFD1的高表达与肝癌患者的总生存期存在正相关，MTHFD2与和肝癌患者的无疾病进展期呈正相关。这些数据之间的差异可能需要通过进一步扩大样本量来校正。在MTHFD与免疫浸润细胞的相关性分析中，发现MTHFD2与多种免疫细胞浸润相关，同MTHFR影响免疫细胞浸润一起，这些数据表明叶酸代谢通路与机体免疫相关，提示针对肝癌的免疫治疗如若联合靶向叶酸代谢通路的药物，可能会起到更优的治疗效果。

图5 叶酸代谢通路关键基因与免疫细胞浸润的相关性分析

SHMT包括SHMT1和SHMT2，SHMT2在多种肿瘤中高表达，抑制SHMT2的表达可以抑制肿瘤细胞的生长和侵袭[9,10]。本研究发现SHMT1在肝癌中多为基因扩增和缺失突变，SHMT2多表现为基因扩增及错义突变，提示肝癌中SHMT除了表达量的改变会影响肝癌的恶性生物学行为外，其基因功能的缺失也可能参与肝癌的发生发展过程。

通过在线数据库对这些基因进行基因或蛋白质互作分析，在两个数据库的分析结果中均发现与异硫氰酸烯丙酯(AITC)基因存在相互关联。研究显示AITC参与肿瘤细胞的有丝分裂，与肿瘤细胞的凋亡相关[11]。AITC有抗细胞增殖、抗血管新生的作用，能通过影响巨噬细胞发挥免疫调节效应[12-14]。可以推断，叶酸代谢通路基因可与AITC相互作用，影响肝癌的发生发展。

综上，叶酸代谢通路的关键基因在肝癌的发生发展过程中起着重要的作用，肝癌患者中这些基因的改变除了影响叶酸代谢通路的调控以外，还能够通过影响人体的免疫微环境，以及与其他基因及代谢通路一起参与肝癌的发生发展过程。