Hippo信号通路中MST1和MST2的表达在肝癌干细胞干性维持和自我更新中的意义

闾少冬 魏勇鹏 王卓 袁建勇 卢军华

肝细胞癌是目前全球第六大常见的恶性肿瘤，预后总体较差，并且患者的生存率在很大程度上是由肝细胞癌的分期决定的[1]。目前肝细胞癌治疗后复发率仍较高[2-3]。因此对肝细胞癌的形成和发生的深入研究，对于肝细胞癌的发现和早期筛查，提高肝细胞癌的治愈率，降低肝细胞癌的病死率，就显得尤为重要。

Hippo信号通路，不论是在果蝇这类的模式生物中，还是在高等的哺乳动物中，都是高度保守的。它的功能主要涉及控制细胞生长、增殖、凋亡、分化和器官大小等[4]。Hippo信号通路通过上游调节蛋白接收来自细胞外的生长抑制信号，然后将信息转移到主要核心激酶，最后转移到下游效应器[5]。最近的大量研究证实了Hippo信号在癌症发生中的作用。Hippo通路实际上是一种肿瘤抑制通路，功能异常的Hippo信号通路参与了多种生物学过程[6]。

材料与方法

一、实验材料

(一)实验组织材料 本研究从东方肝胆外科医院肝外五科收集了32例肝癌组织样本和30例正常肝组织样本。根据肝癌AFP水平分类，32例肝癌患者中AFP水平<25.0 μg/mL的占3例，AFP水平在25.0～200.0 μg/mL的占16例，AFP水平>200.0 μg/mL的占13例；30例肝良性增生患者中AFP水平<25.0 μg/mL的占11例，AFP水平在25.0～200.0 μg/mL的占11例，AFP水平>200.0 μg/mL的占8例。本研究经医院伦理委员会批准同意，所有纳入个体均签署书面知情同意书。

(二)实验细胞材料 本研究中使用的L-02细胞、Huh7细胞、SK-Hep1细胞和HepG2细胞均购自中国科学院上海生命科学研究所细胞库，SMMC-7721细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。L-02细胞、SK-Hep1细胞和HepG2细胞培养使用的MEM培养基购自Gibco，Huh7细胞培养使用的DMEM培养基购自Hyclone，SMMC-7721细胞培养使用的RPMI-1640培养基购自Gibco。培养基中均需加入10%胎牛血清，胎牛血清购自Excell。所有细胞均置于37 ℃含有5% CO2的恒温箱中培养。

二、细胞转染

转染实际脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen，操作方法参照Invitrogen的产品说明。消化细胞并铺到12孔板中，待细胞完全贴壁且达到约60%汇合度时进行细胞转染。MST1和MST2的shRNA均由Tsingke公司设计并合成。

三、主要分子和化学试剂

RNA抽提所用的RNAiso试剂购自Takara；酚氯仿异戊醇、异丙醇等化学试剂购自申试；RNase free water购自Takara；逆转录试剂盒购自Promrga；Oligo dT18购自Takara；SYBR Green荧光定量试剂盒均购自Bio-rad。Western blot实验所用的RIPA细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒均购自Beyotine；SDS-PAGE预制胶和蛋白电泳相关试剂均购自雅酶；脱脂奶粉购自BD；PVDF膜购自GE healthcare；ECL显色液购自Millipore。

四、qRT-PCR

使用RNAiso裂解细胞至无RNA酶的1.5 mL EP管中，参照RNAiso的产品说明书提取肝癌组织或肝癌细胞中的总RNA。使用MMLV逆转录试剂盒，将总RNA逆转录为cDNA，反应体系和程序参照Promega公司的产品说明书。使用RNase free water将逆转录得到的cDNA稀释10倍，并作为模板进行qRT-PCR检测，qRT-PCR实验使用Bio-rad公司的SYBR Green荧光定量试剂盒，具体的反应体系和程序参照Bio-rad公司的产品说明书。qRT-PCR反应所用引物见表1。

表1 本研究所用引物序列

五、Western blot

使用RIPA裂解液收集细胞至1.5 mL的EP管，通过BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白的浓度，向细胞裂解液中加入蛋白loading buffer煮沸5 min后，按每孔10 μL的比例上样到10% SDS-PAGE胶中，使用80 V电压，电泳1 h至蛋白样品彻底分层。随后在280 mA恒流条件下转膜。将膜转移到5%脱脂奶粉中封闭1 h，分别加入TBST稀释的一抗，稀释比例和孵育时间参照各个一抗的产品说明，使用TBST充分洗膜后加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜3次。ECL显色液显影。应用凝胶图像分析软件Image J分析各条带的灰度值，计算目的蛋白与内参蛋白条带的灰度值比值。实验重复3次。实验中所用抗体MST1(A0109)、MST2(A9036)、GAPDH(A19056)、AMPK(A12718)、p-AMPK(AP0116)、OCT-4(A7920)、Nanog(A14150)以及对应的兔二抗(AS014)和鼠二抗(AS003)均购自爱博泰克。

六、免疫组织化学染色

将肝癌组织和正常的肝组织，于4%多聚甲醛液固定，常规石蜡包埋，4 μm连续切片，常规脱蜡处理。微波加热修复抗原，至沸腾后停止加热5 min，然后重复加热一次，冷却至常温。PBS冲洗切片后滴加正常山羊血清封闭液封闭。HistostainTMSP-9000免疫组化染色试剂盒(Zymed公司)染色。分别使用MST1和MST2一抗4 ℃处理过夜。复温并用PBS冲洗后，滴加对应的二抗，于37 ℃下30 min。PBS冲洗后滴加辣根标记工作液孵育，DAB显色5～10 min，镜下调整染色时间，苏木精复染1 min后树胶封片，拷片后拍照保存。

七、流式细胞术

收集SMMC-7721细胞，使用0.25%胰蛋白酶消化，细胞计数并调整细胞悬液浓度至1×106/mL，取1 mL细胞1 500 r/min离心10 min，弃上清，每毫升细胞加2 mL PBS，再离心，弃上清后，加入预冷的70%乙醇固定细胞，4 ℃过夜。第二天用PBS洗涤细胞2次，取100 μL细胞悬液，将细胞悬液加入0.5 mL含50 μg/mL RNAase PI溶液中，避光30 min后用100目的尼龙网过滤，流式细胞仪分别记录CD90+、CD105+和CD133+型细胞的分布情况。

八、统计学分析

所有数据均采用SPSS 21.0统计学软件(USA)进行处理，计量资料采用均值±标准差的形式表示，两组间比较为t检验，多组间的比较应采用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有显著性统计学意义。

结 果

一、MST1和MST2在肝癌中高表达

为了研究MST1和MST2在肝癌中的作用，笔者首先检测了MST1和MST2在肝癌中的表达情况。我们从东方肝胆外科医院肝外五科取32例肝癌组织样本，以及30例正常的肝组织样本，通过qRT-PCR和免疫组化实验检测了MST1和MST2的表达情况。结果表明在肝癌组织中，MST1和MST2均显著高表达(图1A、图1B)。通过qRT-PCR和Western blot在肝癌细胞系Huh7、SK-Hep1、HepG2和SMMC-7721中检测MST1和MST2的表达情况。qRT-PCR结果表明，对比人正常肝细胞L-02，MST1和MST2在Huh7、SK-Hep1、HepG2和SMMC-7721中的表达分别为：2.16±0.25、1.73±0.15、2.63±0.31、2.36±0.25；1.97±0.21、2.12±0.19、2.76±0.18、2.92±0.21。其中MST1和MST2的表达在HepG2和SMMC-7721肝癌细胞系中的表达最高(图1D)，因此使用HepG2和SMMC-7721细胞系作为后续实验的研究材料。以上结果表明，MST1和MST2在肝癌中高表达，提示MST1和MST2与肝癌的发生密切相关。

二、SMMC-7721中肝癌干细胞的鉴定

为了研究MST1和MST2在肝癌干细胞自我更新过程中的作用。本研究首先通过流式细胞术检测肝癌干细胞表面标志物CD90、CD105、CD133，发现CD90+、CD105+、CD133+型的细胞在SMMC-7721细胞中占有一定比例(图2A)，笔者从中分选出CD90+、CD105+、CD133+的SMMC-7721细胞作为肝癌干细胞模型进行后续研究。经过分选的SMMC-7721肝癌干细胞，通过镜检发现其形成微球体的能力显著增强(图2A)。在SMMC-7721肝癌干细胞中，检测干细胞标准蛋白AMPK、OCT-4和Nanog的表达。qRT-PCR结果显示，相比普通肝癌细胞HepG2，AMPK在肝癌干细胞SMMC-7721中的表达情况无明显变化，而OCT-4和Nanog的表达分别为2.56±0.21、2.32±0.11，提示OCT-4和Nanog在肝癌干细胞中显著上调。Western blot结果显示，在肝癌干细胞中AMPK的磷酸化水平显著增加，OCT-4和Nanog的表达上调趋势与qRT-PCR结果一致(图2B)。以上结果表明，通过检测干细胞微球体的形成以及干细胞标志物AMPK、OCT-4和Nanog的表达，本研究成功诱导了SMMC-7721肝癌干细胞。

图1 MST1和MST2在肝癌中高表达A：qRT-PCR检测肝癌组织中MST1和MST2的表达，*表示与Normal组相比P<0.05；B：免疫组化检测肝癌组织中MST1和MST2的表达；C：Western blot检测肝癌细胞中MST1和MST2的表达。所有实验均重复3次

三、MST1和MST2促进了肝癌干细胞的干性维持

为了研究MST2和MST2对肝癌干细胞自我更新的影响，笔者分别设计并合成了MST1和MST2的shRNA，通过Western blot检测shRNA的敲低效率。结果显示三对shRNA均能成功敲低MST1(图3A)和MST2的表达(图3B)。在SMMC-7721肝癌干细胞中，敲低MST1和MST2后，肝癌干细胞微球体显著减少(图3C)。通过qRT-PCR结果显示，检测了敲低MST1后，OCT-4和Nanog的表达下调为0.48±0.02和0.26±0.08；敲低MST2后，OCT-4和Nanog的表达下调为0.35±0.06和0.42±0.03。Western blot结果显示，敲低MST1和MST2，AMPK的磷酸化水平显著减弱，OCT-4和Nanog的下调趋势与qRT-PCR结果一致(图3D)。干细胞标志物指标表明，MST1和MST2的敲低抑制了肝癌干细胞的干性维持能力。

讨 论

近年的研究表明，Hippo信号通路的活性被证实在多种肿瘤的发生过程中异常上调，例如在约17%的宫颈鳞状细胞癌、约16%的鳞状细胞癌、约15%的食管鳞状细胞癌和约14%的头颈部鳞状细胞癌中观察到YAP1、Taz和Tead2的癌基因激活和扩增[7]。当然其中不乏在肝癌中的研究。过表达的YAP可以促进肝脏生长，由此也可以促进肝细胞癌的快速发展，表明Hippo信号通路是调节肝细胞癌的重要因素[8]。更深入的研究表明，在晚期的肝细胞癌中通过siRNA-LNPs技术抑制YAP1的表达，有着很好的抑制肿瘤的效果[9]。在肝癌中，Hippo信号通路受到多种信号通路相互作用，与包括Wnt通路，Notch通路还有GPCRs通路在内的多个通路共同调节肿瘤的发生和发展。在MST1和MST2缺陷的肝脏中，Notch调控了一个正反馈回路，从而增强YAP信号，并进一步促进肝癌的发生。YAP1也被证明可以促进JAG1的表达上调，从而在肝癌细胞中激活Notch信号通路，这表明两种通路之间存在相互作用[10]。而Wnt信号通路可以通过干扰Notch-YAP的反馈反应，抑制肝癌细胞中YAP/TAZ信号[10-11]。

Wang等[12]的研究发现，在肝癌中，MST1和MST2的过表达可以抑制细胞的增殖，促进YAP1的磷酸化，进一步在mRNA水平上下调CTGF和AREG的表达。此外，转录因子CREB通过与YAP启动子的-608/-439位点结合促进YAP1的表达[13]。MEK1-YAP1的相互作用被证明对肝癌细胞的增殖和肿瘤发生很重要[14]。各种膜相关蛋白，如NF2/Merlin、WWC和Angiomotin家族的Scaffolding蛋白已被证明可调节Hippo信号通路[15-16]。进一步的研究表明，在肝癌细胞中，Sirtuin 1(SIRT1)可以使YAP2蛋白去乙酰化，增加YAP2和Tead4结合，增强Trad4的转录水平，最终导致肝癌的进展[17]。

A：流式细胞术分选细胞中CD90、CD105和CD133阳性的细胞，并通过显微镜镜检细胞的微球体形成情况；B：Western blot检测SMMC-7721肝癌干细胞中干细胞标志物的表达。所有实验均重复3次图2 SMMC-7721中肝癌干细胞的鉴定

A：Western blot检测MST1的敲低效果；B：Western blot检测MST2的敲低效果；C：镜检观察MST1和MST2敲低后干细胞微球体形成情况；D：Western blot检测肝癌干细胞中敲低MST1和MST2后干细胞标志物的表达。所有实验重复3次图3 MST1和MST2促进了肝癌干细胞的干性维持

在本研究中，笔者发现MST1和MST2在肝癌组织和肝癌细胞中，表达显著上调，提示MST1和MST2在肝癌的进程中起着重要的作用。在SMMC-7721细胞中，通过流式细胞术筛选到CD90+、CD105+、CD133+的表型，并发现这类表型的细胞，微球体的形成能力显著变强，提示SMMC-7721细胞可以作为一个很好的细胞模型来进行肝癌干细胞的研究。因此在SMMC-7721 CD90+、CD105+、CD133+型的细胞中，笔者敲低了MST1和MST2，结果表明敲低MST1和MST2均能显著抑制微球体的形成，并且干细胞标志物AMPK的磷酸化水平显著下调，OCT-4和Nanog的表达也被显著抑制。本研究的结果作为Hippo信号通路在肝癌干细胞中的初步探索，很好地证实了抑制Hippo信号通路活性可以抑制肝癌干细胞的自我更新和干性维持，为Hippo信号通路在肝癌中的研究开辟了新的思路。