miR-548a-5p靶向HMBOX1调控肝癌细胞HepG2的凋亡研究

袁溢苒 陈龙 张臻

肝癌，包括成人的肝细胞癌(HCC)和胆管癌(CCA)，以及主要在儿童中发病的肝母细胞瘤(HB)，是目前对抗癌药物反应不良的最恶性肿瘤之一[1-2]。有许多证据表明，多种miRNA在肝癌组织中显示失调，并在癌症的发展中起重要作用，包括miR-548a-5p[3-4]。miR-548a-5p是前列腺疾病的病程变化的肿瘤标志物[5]。然而，关于miR-548a-5p在肝癌中的生物学作用，目前尚未有研究。miR-548a-5p是否与凋亡相关，其潜在的分子机制值得探讨。基于此，本研究以肝癌细胞HepG2作为研究对象，旨在探讨miR-548a-5p调控肝癌细胞HepG2凋亡的潜在机制。

材料与方法

一、一般材料

肝癌细胞HepG2购自procell公司(货号：CL-0103)。LIPOFECTAMINE MESSENGERMAX转染试剂购自英潍捷基(上海)贸易有限公司(货号：LMRNA008)。GAPDH的抗体购自上海机纯实业有限公司[货号：ml4041550(s)]。HMBOX1(homeobox containing 1)抗体购自北京达科为生物技术有限公司(货号：10R-1687)。siGFP和siHMBOX1(靶序列：GGAAGTTCATATGGGAATA)由吉凯基因合成。HMBOX1过表达质粒通过肝癌细胞HepG2的cDNA克隆至pCDNA3.1表达载体上。RPMI-1640培养基购自北京普益华科技有限公司(货号：R8005-10X1L)。胎牛血清购自广州市左克生物科技发展有限公司(货号：HQ30071)。总RNA小量提取试剂盒购自广州市左克生物科技发展有限公司(货号：T2010S)。实时荧光定量PCR试剂盒购自广州聚研生物科技有限公司(货号：116.C6028-50T)。M-MLV逆转录酶购自广州市齐云生物技术有限公司(货号：R1041)。

二、研究方法

(一)细胞培养与转染 人肝癌细胞系HepG2(HCC/HB)在补充有10% FBS的RPMI-1640培养基中培养。根据制造商的说明，LIPOFECTAMINE MESSENGERMAX转染试剂与siGFP、siHMBOX1、miR-548a-5p mimics、miR-548a-5p inhibitor、Vector和HMBOX1混合后转染HepG2细胞。

(二)免疫印迹 从用RIPA裂解缓冲液[50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1%NP-40、0.5%脱氧胆酸钠，150 mmol/L NaCl和1 mmol/L PMSF裂解的细胞中提取总蛋白，并用BSA测定浓度方法。通过在10%聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE分离蛋白(30 μg/泳道)，然后转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上。在室温下，将膜用5%脱脂牛奶在TBS/0.1% Tween-20中封闭1 h。然后用特异性抗体(1∶1 000)检测HMBOX1和GAPDH。将蛋白质与二抗在室温下孵育1 h，并使用Immobilon Western化学发光HRP底物观察条带，并使用Alpha Ease FC软件进行分析。

(三)Annexin-V染色 经过不同处理后，收集在6孔板上生长的漂浮，肝癌细胞HepG2和胰蛋白酶分离的细胞，并用预冷的PBS洗涤。然后将细胞沉淀物用结合缓冲液重悬，并根据试剂盒方案用Annexin-V染色。荧光显微镜观察。将实验组中凋亡细胞的百分比与对照转染组进行比较。所有样品一式三份测量。

(四)RNA抽取与实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 使用总RNA小量提取试剂盒从细胞中提取总RNA，并根据制造商的说明使用M-MLV逆转录酶合成cDNA。协议。使用iCycleriQ实时PCR系统和实时荧光定量PCR试剂盒检测特定的转录本。将特定转录物的表达标准化至GAPDH水平。qRT-PCR从变性(95 ℃持续25 s)，退火(60 ℃持续20 s)和延伸(72 ℃持续30 s)三个步骤开始。

三、统计学分析

结 果

一、miR-548a-5p抑制肝癌细胞HepG2的凋亡

转染miR-548a-5p mimics过表达miR-548a-5p后，检测细胞的凋亡水平，结果显示HepG2的凋亡水平下降；转染miR-548a-5p inhibitor敲低miR-548a-5p后，检测细胞的凋亡水平，结果显示HepG2的凋亡水平上升(P<0.05)。这说明miR-548a-5p能抑制肝癌细胞HepG2的凋亡

二、miR-548a-5p靶向HMBOX1

通过miRDB在线分析发现，miR-548a-5p潜在靶向FAM135A,NFAT5,RORA,FIGN,HMBOX1,CCNY,RMND5A,LRRTM3,UBE2A,RALA基因。过表达miR-548a-5p后，HMBOX1的水平显著下降(P<0.05)；敲低miR-548a-5p后，HMBOX1的水平显著上升(P<0.05)，其余基因均无显著变化。通过荧光素酶报告实验发现miR-548a-5p靶向HMBOX1的3端非编码区(P<0.05)。

三、miR-548a-5p靶向HMBOX1抑制肝癌细胞HepG2的凋亡

通过siRNA敲低HMBOX1后，发现HepG2的凋亡水平显著下降(P<0.05)；通过HMBOX1质粒过表达HMBOX1后，发现肝癌细胞HepG2的凋亡水平显著上升(P<0.05)。同时过表达或敲低miR-548a-5p和HMBOX1，HepG2的凋亡水平无明显变化。敲低和过表达效率见图3A和图3B。因此，miR-548a-5p靶向HMBOX1抑制HepG2的凋亡。

图1 HMBOX1促进肝癌细胞HepG2的凋亡(P<0.05)

讨 论

miRNA在基本的细胞过程中起着至关重要的作用，这些过程包括但不限于增殖、发育、分化、凋亡和自噬[6-7]。在本研究中，miRNA在肝癌发生发展中发挥着不可忽视的调控作用，主要是通过靶向于相关通路中的关键基因实现的，包括凋亡、自噬等信号通路[8-9]。研究发现miR-548a-5p是前列腺癌病程变化的标志基因，也与肝癌的发生发展有关[10-11]。本研究发现过表达miR-548a-5p后，HepG2的凋亡水平下降；敲低miR-548a-5p后，凋亡水平上升(P<0.05)，因此，miR-548a-5p可能是治疗肝癌的潜在治疗靶点。miRDB在线分析发现miR-548a-5p潜在靶向FAM135A,NFAT5,RORA,FIGN,HMBOX1,CCNY,RMND5A,LRRTM3,UBE2A,RALA基因。过表达miR-548a-5p后，HMBOX1的表达明显下降；敲低miR-548a-5p后，其表达量显著上升(P<0.05)。miRNA通过与3’UTR结合来调节靶基因的表达，从而引起mRNA降解或翻译抑制。因此，本研究通过荧光素酶报告系统发现miR-548a-5p靶向于HMBOX1的3端非编码区(P<0.05)。

HMBOX1是一种新的人类homeobox基因，首次从人类胰腺cDNA文库中分离得到，是一种转录因子，研究表明，其可以抑制肝癌细胞的增殖[12-13]。敲低HMBOX1后，HepG2的凋亡水平显著下降；而过表达后则相反(P<0.05)。Lin等[14]报道HMBOX1通过与MT2A相互作用调节细胞内游离锌水平，抑制细胞凋亡，促进细胞自噬。同时敲低或过表达miR-548a-5p和HMBOX1，凋亡水平未发生明显改变。因此，作为HMBOX1的上游，miR-548a-5p可能抑制细胞自噬。细胞自噬已经被证明与癌症耐药相关[15]。因此，miR-548a-5p可能是肝癌耐药的潜在原因之一。

综上所述，miR-548a-5p通过靶向HMBOX1的mRNA的3端非编码区抑制HMBOX1的翻译，从而抑制肝癌细胞HepG2的凋亡。