长春新碱调控PI3K/Akt信号通路抑制肝癌细胞Hep3B增殖迁移侵袭及促进细胞凋亡的机制研究*

刁云辉 刘 琳 沙金平 薛 萌

1.河南省南阳市中心医院消化内科 (河南 南阳，473000) 2.河南省南阳市中心医院心内一科

肝癌是常见的恶性肿瘤，具有较高的发病率和死亡率，严重威胁人类生命健康[1]。长春新碱主要是从长春花叶中提取的二聚吲哚类化合物，具有良好的抗肿瘤作用。长春新碱通过作用于肿瘤细胞微管蛋白而干扰肿瘤细胞代谢，在临床中主要用于治疗急性淋巴细胞白血病、何金杰及非何金杰淋巴瘤[2]。磷脂酞肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路参与调控细胞的增殖、凋亡等生命过程，在肿瘤的发生发展过程中起重要作用[3，4]。研究显示，PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活可促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭[5]。目前，长春新碱能否通过调控PI3K/Akt信号通路发挥抗肝癌作用还未知。因此，本研究以肝癌Hep3B细胞为研究对象，旨在探究长春新碱对Hep3B细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及是否通过调控PI3K/Akt信号通路发挥作用。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂 肝癌细胞系Hep3B购自中国科学院上海细胞库；胎牛血清(FBS)购自浙江天杭生物科技股份有限公司；RPMI 1640培养基、细胞计数试剂盒-8(CCK-8)和二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；胰岛素样生长因子-1(IGF-1)购自美国Sigma公司；兔抗人Ki-67、基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9、磷酸化磷脂酞肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)和β-肌动蛋白(β-actin)抗体购自北京中杉金桥生物试剂公司，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 Hep3B细胞用含10% FBS的RPMI 1640培养基培养，培养箱环境为温度37℃、CO2体积分数5%、湿度97%。当细胞融合至80%时，0.25%胰蛋白酶溶液消化，以1∶2～1∶3比例传代培养。

1.2.2 细胞分组处理 Hep3B细胞分为对照组(NC组)、不同浓度(0.02、0.04、0.08 μmol/L)[6]长春新碱组、长春新碱+IGF-1组。对照组细胞常规培养基正常培养24 h；不同浓度长春新碱组细胞分别用含终浓度为0.02、0.04、0.08 μmol/L长春新碱的培养基培养24 h；长春新碱+IGF-1组细胞用含终浓度为0.04 μmol/L长春新碱和100 ng/ml IGF-1[7]的培养基共同培养24 h。

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖 调整Hep3B细胞浓度为2.5×104个/ml，每孔200 μl接种于96孔板中。按照上述分组处理，培养结束后，加入10 μl CCK-8试剂，酶标仪测定450 nm处光密度(OD)值。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 调整Hep3B细胞浓度为2.5×104个/ml，每孔1.0 ml接种于24孔板中。按照上述分组处理，培养结束后，胰蛋白酶消化，收集细胞。参照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书，加入10 μl Annexin V-FITC，避光孵育10 min。加入5 μl PI，避光孵育10 min后，采用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.5 Transwell检测细胞迁移和侵袭 调整Hep3B细胞浓度为5×104个/ml。迁移实验：取Transwell上室加入100 μl细胞悬液，下室加入500 μl含FBS的培养基。按照上述分组处理，培养结束后，吸弃培养基。取出小室，以4%多聚甲醛固定30 min，0.4%结晶紫染色15 min，倒置显微镜观察，随机选取5个视野，拍照并计数。侵袭实验：Transwell上室铺Matrigel基质胶，自然晾干后加入100 μl细胞悬液，后续操作同迁移实验。

1.2.6 Western Blot法检测细胞中相关蛋白表达 RIPA试剂提取细胞中总蛋白，BCA法测定蛋白含量后进行定量，然后行10% SDS-PAGE电泳。电泳后，湿转至PVDF膜，5 %脱脂奶粉封闭2 h。分别加入Ki-67(1∶800)、Cleaved-caspase-3(1∶1 000)、MMP2(1∶800)、MMP9(1∶800)、p-PI3K(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)一抗，4℃孵育过夜。加入辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗(1∶5 000)，37℃孵育1 h。加入化学发光试剂避光显影，凝胶成像系统曝光拍照。

2 结果

2.1 不同浓度长春新碱对Hep3B细胞增殖的影响 与NC组比较，不同浓度长春新碱作用Hep3B细胞后，细胞OD 450 nm值和Ki-67蛋白表达降低(P<0.05)，见图1、表1。

图1 Western Blot检测不同浓度长春新碱对Hep3B细胞中Ki-67蛋白表达的影响

表1 不同组别对Hep3B细胞OD450nm值和Ki-67蛋白表达的影响

2.2 长春新碱对Hep3B细胞凋亡的影响 与NC组比较，不同浓度长春新碱作用Hep3B细胞后，细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表达升高(P<0.05)，见图2、表2。

图2 长春新碱对Hep3B细胞凋亡及Cleaved-caspase-3蛋白表达影响图 (A.流式细胞仪检测细胞凋亡；B.Western Blot检测Cleaved-caspase-3蛋白表达)

表2 不同组别对Hep3B细胞凋亡的影响

2.3 长春新碱对Hep3B细胞迁移和侵袭的影响 与NC组比较，0.04 μmol/L长春新碱作用Hep3B细胞后，细胞迁移和侵袭数、MMP2和MMP9蛋白表达降低(P<0.05)，见图3、表3。

图3 长春新碱对Hep3B细胞迁移和侵袭的影响图 (A.Transwell检测细胞迁移侵袭；B.Western Blot检测MMP2和MMP9蛋白表达)

表3 不同处理方法组别对Hep3B细胞迁移和侵袭的影响

2.4 长春新碱对PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响 与NC组比较，0.04 μmol/L长春新碱作用Hep3B细胞后，细胞中p-PI3K和p-Akt蛋白表达降低(P<0.05)，见表4、图4。

图4 Western Blot检测p-PI3K、p-Akt蛋白的表达

表4 不同处理方法组别对JAK/STAT3信号通路相关蛋白表达的影响

2.5 IGF-1可以逆转长春新碱对Hep3B细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响 与0.08 μmol/L长春新碱组比较，长春新碱+ IGF-1组长春新碱作用Hep3B细胞后，细胞OD 450 nm值、迁移和侵袭数及Ki-67、MMP2和MMP9蛋白表达升高(P<0.05)，细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表达降低(P<0.05)，p-PI3K和p-Akt蛋白表达升高(P<0.05)，见图5、表5。

表5 不同处理方法组别对Hep3B细胞增殖、迁移侵袭和凋亡的影响

图5 Western Blot检测Hep3B细胞Ki-67、Cleaved-caspase-3、MMP2、MMP9、p-PI3K、p-Akt蛋白的表达图

3 讨论

长春新碱是从夹竹桃科植物长春花中提取出的生物碱，已被临床用于治疗白血病，且具有较好的治疗效果，另外其对淋巴瘤、乳腺癌等肿瘤也具有一定的治疗疗效。长春新碱的抗肿瘤靶点是微管蛋白，其主要抑制微管蛋白的聚合影响纺锤体的形成，抑制有丝分裂过程。此外，长春新碱还可抑制癌细胞内RNA酶活性，导致细胞内DNA、嘌呤等物质无法正常合成，蛋白质代谢紊乱，细胞膜受损等，最终使肿瘤细胞凋亡。

细胞增殖紊乱和凋亡受阻是肿瘤发生的重要机制之一，抑制肿瘤细胞增殖并诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的重要途径[8]。Ki-67参与细胞有丝分裂过程，是细胞增殖的标志性蛋白，可反映细胞增殖活性[9]。caspase-3是caspase家族的重要成员，其活化后进一步切割下游分子，诱导细胞发生不可逆的凋亡[10]。本研究显示，长春新碱可剂量依赖性降低Hep3B细胞OD值及Ki-67蛋白表达，而促进Hep3B细胞凋亡及Cleaved-caspase-3蛋白表达，与相关研究报道[11]结果一致，表明长春新碱可抑制Hep3B细胞增殖，并诱导细胞凋亡，发挥抗肝癌作用。肿瘤细胞迁移和侵袭是肿瘤复发和转移的主要原因[12]，抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭对于降低肿瘤复发和转移具有重要意义。本研究显示，0.08 μmol/L长春新碱可剂量依赖性降低Hep3B细胞的迁移和侵袭数及细胞中MMP2和MMP9蛋白表达，与相关报道结果一致[13]，表明长春新碱可抑制Hep3B细胞迁移和侵袭。

PI3K/Akt信号通路参与调节细胞生长、增殖和代谢等过程，与人类肿瘤的发生发展密切相关[14]。研究显示，STYXL1可通过激活PI3K/Akt途径下调CELF2来促进肝癌细胞增殖并抑制细胞凋亡[15]。miR-616在肝癌组织和细胞系中表达升高，敲低miR-616通过抑制PI3K/AKT途径减弱肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[16]。本研究显示，0.08 μmol/L长春新碱可抑制Hep3B细胞中p-PI3K和p-Akt蛋白的表达，提示长春新碱可能通过抑制PI3K/Akt信号通路的激活发挥抗肝癌作用。IGF-1是一种促生长肽类激素，可激活PI3K/Akt信号通路[17]。研究显示，IGF-1可通过促进早期生长反应蛋白1(EGR1)表达增强肝癌细胞的迁移和侵袭能力[7]。本研究显示，IGF-1与长春新碱共同作用Hep3B细胞后，细胞增殖、迁移和侵袭能力升高，而凋亡程度降低，表明IGF-1逆转了长春新碱对Hep3B细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用及凋亡促进作用，进一步说明长春新碱通过抑制PI3K/Akt信号通路发挥抗肝癌作用。

综上所述，长春新碱可抑制肝癌Hep3B细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡，发挥抗肝癌作用，其作用机制与抑制细胞中PI3K/Akt信号通路的激活有关。