疏肝消脂方调控apoB48干预非酒精性脂肪性肝病的肠源性机制研究*

翟芬芬 王燕青 冯 楝 许林艺 江丹生 韩志毅 彭得倜 陈家碧 邢宇锋△

1.深圳市福田区慢性病防治院 (广东 深圳，518000) 2.深圳市中医院肝病科 3.广州中医药大学第四临床医学院

随着肥胖症和代谢综合征在全球的流行以及病毒性肝炎疫苗的普及，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成为发达国家肝功能酶学异常和慢性肝病最常见的原因，NAFLD发病率明显增加并且呈低龄化发展趋势。NAFLD诊断依赖于组织学，需除外由酒精及其他明确肝损害因素，其疾病谱包括单纯性脂肪性肝病、脂肪性肝炎、肝硬化和肝细胞癌[1]。目前NAFLD的治疗方法以改变生活方式、减肥[2]、胰岛素增敏剂及抗氧化剂[3]、保肝药[4]和益生菌[5]为主。单一使用针对某一发病机制的药物无法治愈NAFLD，急需研发安全有效的治疗药物。

中医药在NAFLD的防治中具有极大的优势。课题组童光东教授基于数十年临床经验，根据“肝病传脾”“肝病实脾”理论，从气郁为肝病的主要病机出发，提出“气郁—痰湿内蕴化热—致瘀”为NAFLD的病理机制，创立疏肝消脂方治疗NAFLD。在本研究中，拟观察疏肝消脂方对NAFLD模型大鼠肠道菌群多样性和丰度、肠道屏障功能和肠道脂质转运功能的影响，研究其调节菌群失调、保护肠黏膜屏障、调节载脂蛋白的作用途径，并探讨其防治NAFLD可能的机制，为中医药防治NAFLD提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级Wistar大鼠40 只，雌雄各半，体重(120±20)g，购自广州中医药大学动物中心[合格证号：SYXK(粤)2013-0001]，实验方案已通过深圳市中医院实验动物伦理委员会审查。

1.2 药物及试剂 疏肝消脂方：柴胡、枳实、桅子各10 g，炒白芍、白术各15 g，甘草5 g，茵陈、泽泻、山楂、草决明、荷叶、海浮石各30 g，茯苓20 g等。本研究中药采用免煎剂，由深圳华润三九医药有限公司提供。BSA(A7906，Sigma)；进口脱脂奶粉(M203，Amresco)；蛋白分子量Marker(Invitrogen)；RIPA裂解液(普利莱，P1053)；蛋白酶抑制剂cocktail(11873580001，Roche)；BCA蛋白定量试剂盒(23227，Thermo)。

1.3 实验仪器 石蜡切片机(Leica，德国)；Western blot转膜电泳仪系统(Amersham，BioSciences)；机械匀浆器(Fisher Scientific，125)；恒温振荡器(培英，9211K)；层析实验冷柜(北京博仪康仪器有限公司，YC-1)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组 将40只大鼠随机分为4组：正常组、高脂模型组、疏肝消脂方低剂量组和疏肝消脂方高剂量组。每组10只大鼠。

1.4.2 动物造模及给药 以基础饲料饲养正常组大鼠，其余三组以高脂饲料(胆固醇2%，胆酸钠0.5%，丙硫氧嘧啶0.2%，蔗糖5%，猪油10%，基础饲料82.3%)饲养，诱导高脂模型[6]，高脂饲料喂养8周后，随机从每组中挑选5只大鼠做肝组织病理检测，判断动物模型是否成功。疏肝消脂方低剂量组和高剂量组分别予20、40 g/(kg·d)剂量，给予正常组和模型组用等体积蒸馏水灌胃。取材前1天禁食不禁水，第2天腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，取小肠组织和新鲜粪便。

1.5 观察指标

1.5.1 各组大鼠肠道菌群丰度检测 处死动物前，每组取新鲜大鼠肠粪标本，每组取5个标本。利用Illumina HiSeq测序平台对16S rRNA V3、V3-V4和V6区域进行测序，对20个样本的16S rDNA测序数据在初始数据、OTU、物种丰度和群落结构水平进行常规分析。

1.5.2 各组大鼠小肠组织ZO-1、Occludin和SIgA蛋白表达检测 采用免疫组化法检测各组大鼠小肠组织中ZO-1、Occludin和SIgA蛋白表达情况。方法如下：取出固定于4%多聚甲醛溶液中的小肠组织，进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片处理，切片用二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，3%过氧化氢处理25 min，蒸馏水洗涤2次(5 min/次)，抗原热修复15 min，PBS洗涤2次(5 min/次)。切片与ZO1、Occludin和SIgA抗体在室温下孵育2 h，与Envision二抗(Abcam, Cambridge, UK)在37℃孵育30 min，PBS洗涤2次(5 min/次)，用新鲜配制的DAB液冲洗。用流水终止染色。进一步与苏木精染色4 min,水洗后,加入1%盐酸乙醇，返蓝后流水冲洗15 min。梯度乙醇脱水，二甲苯透明处理，用中性胶密封,显微镜下观察。

1.5.3 各组大鼠小肠组织apoB48蛋白表达检测 采用Western blot法检测各组大鼠小肠组织apoB48蛋白表达情况。方法如下：每组随机抽取5只大鼠，取小肠组织作为样本，匀浆后取上清，测定蛋白浓度，经过上样、电泳、转膜、一抗孵育、二抗孵育、发光、胶片显影后，经扫描仪扫描取图。

2 结果

2.1 疏肝消脂方对大鼠肠道菌群的影响 对新鲜粪便标本进行肠道微生物检测，并进行PCA和聚类分析。结果表明(如图1B所示)，模型组与正常组肠道微生物群落结构有显著性差异。高剂量组和低剂量组与正常组结构相似。如图1A、C所示，模型组肠道菌群中乳酸菌科、产碱杆菌科和卟啉单胞菌科的相对丰度显著降低，而螺旋菌科、拟杆菌科、消化链球菌科和产碱杆菌的相对丰度显著提高。疏肝消脂方处理后，大鼠螺旋菌科、拟杆菌科、弧菌科的相对丰度降低，卟啉单胞菌科的相对丰度显著升高。

图1 疏肝消脂方调节肠道微生物组成和多样性情况图 (A.多样本物种分类图；B.物种丰度分布Heatmap图；C.PCoA分析图)

2.2 疏肝消脂方对大鼠肠道黏膜屏障的影响 与正常组相比，模型组肠紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达水平显著降低(P<0.05)，SIgA表达水平显著升高(P<0.05)。高、低剂量组ZO-1、Occludin蛋白水平明显高于模型组(P<0.05)，SIgA表达明显低于模型组(P<0.05)。见表1、图2。

表1 不同实验组对大鼠肠道黏膜屏障功能相关蛋白表达的影响

图2 各组大鼠小肠病理图 (免疫组化染色，200×)

2.3 对肠道脂质转运蛋白apoB48蛋白的影响 与正常组相比，模型组apoB48蛋白表达水平显著增加(0.493±0.040vs0.164±0.003，P<0.01)；与模型组相比，高剂量组apoB48蛋白水平明显降低(0.186±0.005vs0.493±0.040，P<0.01)，低剂量组apoB48蛋白水平(0.464±0.012)未见明显变化。见图3。

图3 各组大鼠小肠组织apoB48蛋白表达情况

3 讨论

NAFLD病理主要表现为脂肪颗粒沉积于肝脏，肝细胞发生气球样变，炎性细胞增多并浸润肝脏组织，是全身性代谢综合征在肝脏组织中的表现。NAFLD虽为良性疾病，但它有可能发生肝脏纤维化，进而发生肝硬化甚至肝癌。

肠道和肝脏在胚胎时期有共同的起源——前肠，肠道淋巴细胞起源于发育中的肝脏，这种组织的同源性决定了肝脏和肠道组织在生理病理过程中密切相关。门静脉将两个器官从解剖学上紧密联系。在肠道屏障功能受损时，肠道内细菌和内毒素大量进入门静脉系统。内毒素激活肝脏内的巨噬细胞(枯否细胞)释放一系列促炎细胞因子，炎症介质介导肝脏组织损伤。研究发现NAFLD患者摄入过多脂质，肠道内菌群结构因此发生改变，内毒素产生增加，加速肝脏内甘油三酯的合成，失衡的肠道菌群降低分布于外周脂肪组织和肝脏细胞中腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性，脂肪酸氧化减少，脂代谢发生紊乱[7]。肠道菌群与血清炎症因子水平显著相关[8,9]。有研究[10]发现胃癌脾胃虚弱证患者舌苔卟啉单胞菌科与血清白介素-6水平呈负相关。调节肠道菌群已成为治疗NAFLD的新靶点[11]。

apoB48的表达与高脂血症密切相关，apoB48特异性表达于小肠上皮细胞，仅由小肠上皮细胞合成，是甘油三酯(TG)的载脂蛋白[12]。TG与apoB48 结合成乳糜微粒(CM)，通过淋巴循环进入体内。NAFLD 患者存在小肠细菌过度生长(SIBO)和肠粘膜通透性改变现象。肠粘膜完整性的保持极大程度依赖于肠道上皮细胞之间的紧密连接。Occludin、claudin-1和ZO-1作为紧密连接的重要组成部分，组成肠道的机械屏障。这些蛋白可以特异性反映小肠组织紧密连接的完整性，可以通过控制紧密连接的通透性参与上皮屏障功能的调控[13,14]。研究发现，NAFLD患者肠粘膜通透性增高，肠粘膜上皮紧密连接缩短，紧密连接蛋白Occludin、ZO-1明显表达减少[15]。因此从肠道菌群多样性和丰度、肠道屏障功能和肠道脂质转运功能入手，开展NAFLD脂质过载诱发肠道微生态紊乱-肠粘膜屏障障碍-内毒素异位-肝脏炎症损伤机制研究具有重要意义。

前期研究证明，疏肝消脂方能改善NASH患者的临床症状，降低非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠TG、胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)、血浆黏度值和AST水平[16]。同时，疏肝消脂方降低NASH大鼠肝组织TG、TC指数，上调过氧化物酶体增殖剂激活受体α(PPARα)、下调固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)基因的表达，调节肝内脂肪酸代谢，增加脂肪酸β氧化，从而减轻肝脏脂肪沉积程度[17]。

本研究发现，疏肝消脂方低、高剂量组大鼠微生物代谢相关菌群均显著减少，小肠紧密连接变长，肠粘膜通透性降低，提示疏肝消脂方能有效改善NAFLD大鼠肠道菌群失调，改善小肠机械屏障和免疫屏障。同时，不同剂量疏肝消脂方可明显降低apoB48蛋白表达，这表明，疏肝消脂方可能通过下调apoB48蛋白的表达，从而调节肠道菌群和小肠屏障功能，这可能是其治疗NAFLD的机制之一，但还需进一步探讨。