椰子脂肪酸积累及与FatB基因表达关系研究

周丽霞 吴翼 杨耀东

摘 要： 為筛选控制椰子果实中低碳链脂肪酸积累的关键FatB基因，本研究以海南本地高种绿椰四个发育时期的果实为试验材料，参考国家标准GB/T2906-1982谷类、油料作物种子粗脂肪测定方法，用索氏提取法提取果肉脂肪酸，应用气质联用检测技术测定各发育时期脂肪酸含量及组分，同时应用qRT-PCR对椰子脂肪酸合成相关基因FatB1、FatB2及FatB3进行相对定量分析，明确各发育时期椰子果实脂肪酸积累与FatB基因表达量变化之间的关系。结果表明：（1）椰子油含9种脂肪酸成分，在椰子果实发育的早期（第6和第7个月），棕榈酸、硬脂酸和油酸的含量较高，月桂酸和肉豆蔻酸相对含量较低，通过实时荧光定量PCR发现，此时FatB1基因的相对表达量较高。（2）而在椰子果实发育的后期（第8和第9个月），棕榈酸、硬脂酸和油酸的相对含量迅速降低，月桂酸和肉豆蔻酸相对含量迅速升高，FatB2和FatB3基因的相对表达量较高，FatB1的表达量略有降低。该研究初步掌握了椰果各发育时期FatB基因表达量与脂肪酸成分间的变化趋势，该结果为将来筛选控制椰子果实中低碳链脂肪酸积累的关键FatB基因奠定基础，同时为椰子脂肪酸成分的分子改良提供理论依据。

关键词： 椰子， 脂肪酸， FatB基因， 气质联用检测技术， qRT-PCR

中图分类号： Q943  文献标识码： A  文章编号： 1000-3142（2021）07-1165-08

Abstract： In order to screen the key genes controlling the accumulation of low-carbon chain fatty acid in coconut fruit， Hainan high-grade green coconut fruits at four growth stages were used as experimental materials， according to GB/T 2906-1982 method for the determination of crude fats in cereals and oil crop seeds， the oil in fresh fruit of Hainan high-grade green coconut was extracted by Soxhler extractor， the contents and components of fatty acids were determined by GC-MS， and quantitative analyses of FatB1， FatB2 and FatB3 genes were carried out by qRT-PCR. The relationship between fatty acid accumulation and FatB gene expression in coconut fruit at each development stage were clarified. The results were as follows： （1） Coconut oil contains nine kinds of fatty acid. In the early growth stage of coconut fruit development （the 6th and 7th months）， the contents of palmitic acid， stearic acid and oleic acid were higher， and the relative contents of lauric acid and myristic acid were lower. The relative expression of FatB1 gene was higher through real-time fluorescent quantitative PCR. （2） In the later growth stage of coconut fruit （the 8th and 9th month）， the relative contents of palmitic acid， stearic acid and oleic acid decreased rapidly， the relative contents of lauric acid and myristic acid increased rapidly， the relative expression of FatB2 and FatB3 genes was higher， and the expression of FatB1 was lower. Through this study， we preliminarily explored the change trend of FatB gene expression and fatty acid composition in different growth stages of coconut fruit. The results establish foundation for screening the key FatB gene that controls the accumulation of low-carbon chain fatty acids in coconut fruit， and provide theoretical basis for the molecular improvement of fatty acid composition.

Key words： coconut， fatty acid， FatB genes， GC-MS， qRT-PCR

椰子（Cocos nucifera）为棕榈科（Arecaceae）椰子属（Cocos L.）的单子叶植物，原产于东南亚热带雨林地区，目前在全世界90多个热带国家和地区广泛种植（Batugal et al.， 2005）。椰子作为热带地区的重要木本经济油料作物之一，其开发价值很高，新鲜椰肉中的含油量可达33.0%，椰子干中的含油量高达63.0%（段岢君等，2013b）。

椰子油属于典型的月桂酸类油脂，其脂肪酸组成中碳链分布范围较广，囊括了C6～C18的馏分（Marina et al.， 2009;耿薇，2010），其主要成分的是月桂酸和肉豆蔻酸，相对含量高达75.0%以上（Krishnamoorthy et al.， 2019），其中，高含量的月桂酸是其他大部分油料作物所没有的，且这些脂肪酸极易被人体吸收，其在人体内的消化系数为99.3%，远高于花生油、菜籽油和芝麻油等食用油（Damayanti et al.， 2019）。椰子油还可用来做油脂化工产品、牛奶里的脂肪、制造肥皂的原料、去污剂和个人护理产品等。对椰子油的生理活性研究发现，其具有抗氧化活性、调节血浆血脂、减肥与美容、维持体内代谢平衡和抗微生物、增强免疫力等药用功能（邓福明等，2013;禤小凤等，2013;段岢君等，2013a;李晓煜等，2013;颜巧丽等，2013）。在人体中，月桂酸以月桂酸甘油酯的形式存在，该成分可以破坏脂类包被类型的病毒（如艾滋病、肝炎病毒），具有抗病毒的作用（蒋增良等，2015）。此外，椰子油中的月桂酸等脂肪酸，其皂化值高，可增加产品的泡沫和溶解度，据统计每年都有几百万吨的椰子油用于洗涤剂的加工生产（王钰等，2002）。由此可见，椰子油不仅在食用方面，而且在油脂化工和生物燃料等行业均发挥着重要的作用。掌握控制椰子油中低碳链脂肪酸合成的关键FatB基因，为其脂肪酸成分的分子改良提供理论基础。

脂酰-酰基载体蛋白硫脂酶（Fat）对植物脂肪酸的饱和度及其碳链长度均有重要作用，其中，FatB基因家族倾向于生成饱和碳链（赵彦朋，2014）。目前，已在多种植物中克隆到了FatB基因，如李晓斐（2011）克隆得到花生FatB基因序列全长1 617 bp，构建了植物表达载体PBI121-AhfatB，实现了遗传转化。赵彦朋（2014）通过克隆和构建Pbisp-FAD2-FatB载体，发现转基因烟草种子中的棕榈酸和硬脂酸均有显著降低，油酸含量显著性提高。赵彦朋等（2015）通过构建抑制烟草种子FatB表达的载体，发现转基因烟草中油酸含量有所提高。刘祾悦等（2019）利用qRT-PCR分析文冠果种仁油脂脂肪酸形成相关基因的表达模式，发现FatA和FatB基因的低表达和KAR基因的高表达，为文冠果种仁油脂碳十八以上不饱和脂肪酸的形成积累提供了充足的硬脂酸合成前提。目前，针对椰子油脂肪酸成分分析的报道较多（耿薇等，2015;桂青等，2016;周丽霞等，2019），而对调控椰子果实脂肪酸合成的相关基因的研究报道较少。肖勇等（2013）应用椰子转录组数据，挖掘了11个脂酰-ACP硫脂酶基因，通过荧光定量PCR检测上述基因的表达变化，发现FatB基因家族的高表达对中低碳链脂肪酸的积累呈一定的正相关关系。袁怡君（2013）通过克隆椰子胚乳中与中链脂肪酸合成相关的基因FatB，发现转基因烟草种子中肉豆蔻酸（14∶0）、棕榈酸（16∶0）和硬脂酸（18∶0）的相对含量都有不同程度的增加，其他种类脂肪酸含量无明显变化。

目前，关于椰子脂肪酸相关的研究主要集中在生理生化水平，对相关合成基因的表达、功能和合成机制的研究鲜有报道。因此，明确该基因在椰子果肉發育不同阶段的表达变化情况，可为将来研究椰子脂肪酸合成的分子机理及脂肪酸成分的分子改良奠定基础。本文以海南本地高种绿椰为研究材料，应用qRT-PCR和GC-MS检测技术，分析椰子果实不同生长时期FatB1、FatB2及FatB3基因的表达量变化，结合椰子果肉在不同时期各脂肪酸成分的相对含量，明确FatB1、FatB2及FatB3的表达变化与各脂肪酸含量之间的变化趋势，以期为将来深入掌握控制椰子果实中低碳链脂肪酸合成的关键FatB基因及脂肪酸成分的分子改良提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为中国热带农业科学院椰子研究所椰子大观园内本地高种绿椰。将本地高种绿椰在花授粉后起记为第1天，此后的第180天（第6个月）、第210天（第7个月）、第240天（第8个月）和第270天（第9个月）分别摘取同株的椰果和椰子嫩叶，每次取3份重复。椰子嫩叶迅速放于液氮冷却，带到实验室放在-80 ℃保存，果肉于4 ℃冰箱中保存备用。

石油醚（60～90 ℃）、氢氧化钾、甲醇、苯及和正己烷均购自海口琼山莱客科技服务中心，罗氏SYBR Green PCR Master Mix购自Sigma公司。主要仪器设备：Agilent 7890A+5975C气相色谱-质谱联用仪（Agilent），上海亚荣RE52旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），上海熙扬索氏提取器（上海熙扬仪器有限公司），实时荧光定量PCR仪（美国安捷伦Mx3000P型）。

1.2 脂肪酸的提取

参考国家标准GB/T 2906-1982谷类、油料作物种子粗脂肪测定方法，称取5 g椰子果肉，用研钵研磨至粉状后，用滤纸包裹并置于提取器中，向提取瓶内加入200 mL石油醚，80 ℃恒温水浴回流提取约15 h，得无色透明萃取液，应用旋转蒸发仪将其减压浓缩得到样品溶液，用石油醚定容至10 mL。

1.3 脂肪酸甲酯化处理

吸取上述样品提取液1 mL，加入2 mL 0.4 mol·L-1氢氧化钾的甲醇溶液（色谱级）和8 mL苯-石油醚（体积比1∶1），充分振荡后静置15 min，再加入16 mL蒸馏水，充分振荡后放置至溶液清晰分层，吸取上清液，旋转蒸发仪将其减压蒸干，得甲酯化脂肪酸，加入0.5 mL正己烷使其溶解并转移至1.5 mL气相色谱上样瓶中，作GC-MS分析。

1.4 GC-MS条件

GC条件：色谱柱Agilent DB-23（30 m × 250 μm × 0.25 μm），载气为氮气，柱初温180 ℃，以10 ℃·min-1速率加热至220 ℃，维持3 min，平衡时间1 min，进样量1 μL，色谱柱流速1 mL·min-1，分流比1∶40。

MS条件：EI离子源，电子能量80 eV，电子倍增器电压1 kV，质量扫描范围25～450 m·z-1，离子源温度200 ℃，GC-MS接口温度230 ℃，质谱检测时间3 min。

1.5 椰子果肉RNA提取

分别取第6、7、8、9个月的椰子果肉约1 g，用液氮研磨至粉末状，加入1 mL提取液，剧烈震荡并在室温下静置5 min后，于4 ℃ 超高速离心机中10 000 r·min-1离心10 min，取上清，加入600 μL氯仿，混匀后在室温下静置7 min，于4 ℃ 超高速离心机中10 000 r·min-1离心10 min，取上清，加入等体积异丙醇，混匀并在室温下静置10 min，于4 ℃ 超高速离心机中10 000 r·min-1离心10 min，弃上清，加入1 mL 75%乙醇，于4 ℃超高速离心机中7 500 r·min-1离心5 min，弃上清液，开盖干燥3 min，加入20 μL RNase-free H2O溶解。

1.6 RNA逆转录及检测

逆转录分为两个步骤：步骤1总体系为12 μL，其中nuclease-free Water 6 μL，Oligo（dT）18 Primer 1 μL，mRNA 5 μL，65 ℃ 5 min 后，迅速置于冰水中冷却;步骤2体系为8 μL，其中，5×Reaction Buffer 4 μL，Ribolock RNase Inhibitor（20 u·μL-1） 1 μL，10 mM dNTP Mix 2 μL，Reverse Transcriptase（200 u·μL-1）1 μL，将步骤2中的8 μL体系加入步骤1的12 μL体系中，42 ℃ 60 min后70 ℃ 5 min。

采用UBC10内参基因（Xia et al.， 2013）引物（5′-TCGACGATGACATCAACGAAGT-3′，5′-TCTATGAATCCACCAACTCAGC-3′）进行PCR扩增检测，检测体系为10 μL：cDNA 1 μL，UBC10 F/R 引物各0.5 μL，Taq DNA Polymerase 0.2 μL，dNTP Mixture 0.2 μL，10×Taq Buffer（plue Mg2+） 1 μL，ddH2O 6.6 μL。PCR检测程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s进行35个循环，72 ℃ 7 min。琼脂糖凝胶电泳， 1.0%凝胶，1×TAE缓冲液，120 V电压电泳25 min，置凝胶于凝胶成像分析系统上检测。逆转录成功的cDNA 母液用灭菌ddH2O稀释10倍，分装备用。

1.7 荧光定量PCR

采用罗氏的SYBR Green PCR Master Mix实时荧光定量试剂盒，在Stratagene Mx3000P 实时荧光定量PCR系统上进行实验，每个目的基因进行三个生物学重复和三个技术重复。反应体系：2×FastStart Universal SYBR Green Master 缓冲液5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，Rox 0.2 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 2.8 μL，反應总体积10 μL。反应程序：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。引物用Primer Premier 5.0 进行设计，引物信息见表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.8方法

应用SHIMADZU GC/MS solution Release 2.10对GC-MS图谱进行鉴定和定量分析，根据GC-MS联用测定得到的质谱信息，应用NIST 11数据库进行检索，通过与标准谱图进行对照，确定每个成分的化学结构。引物设计采用Primer Premier 5.0软件，应用Applied Biosystems 实时荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR，Excel 2010进行数据分析处理。

2 结果与分析

2.1 各生长时期椰子果肉脂肪酸含量分析

采用索氏提取法提取新鲜椰子果肉四个生长时期的脂肪酸，如图1所示，测得第6个月的椰子果肉脂肪酸相对含量为12.5%，第7个月的椰子果肉脂肪酸相对含量为23.6%，第8个月的椰子果肉脂肪酸相对含量为27.0%，第9个月的椰子果肉脂肪酸相对含量为33.5%。随着椰子果实的发育，果肉中脂肪酸的含量不断增加。本研究结果与段岢君等（2013b）调查的结果基本相符。

2.2 椰子果肉脂肪酸的组成及相对含量

应用GC-MS技术分别测定四个生长时期椰子果肉的脂肪酸成分及相对含量，结果如图2-5所示，由脂肪酸甲酯的总离子流色谱图可知，各生长时期椰子果肉中含有的脂肪酸成分完全相同，都含有己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸饱和脂肪酸以及油酸、亚油酸不饱和脂肪酸，保留时间均在6～28 min之间。各时期脂肪酸成分的相对含量变化较大，在椰子果实发育早期（第6和第7个月），棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸的相对含量在10.0%～30.0%之间，远大于己酸、辛酸、癸酸、 月桂酸和肉豆蔻酸的相对含量。在椰子果实发育的后期（第8和第9个月），棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸的相对含量逐渐减少，尤其是在第9个月时，其相对含量降到了10.0%以下;而月桂酸和肉豆蔻酸的相对含量迅速增加，在第9个月时，肉豆蔻酸的相对含量达到了20.6%，月桂酸的相对含量高达49.85%。

2.3 实时荧光定量PCR检测FatB基因表达水平

实时荧光定量PCR结果采用比较阈值法（2-ΔΔCt法）（Livak et al.， 2001）对各功能基因在细胞中的转录水平进行相对定量，对样本中特定mRNA的检测是建立在内参样本基础上的，将定量测定结果表示为靶mRNA/内参样本mRNA的比值，确定在椰子果肉生长的四个不同时期脂肪酸合成相关功能基因表达水平。图6展示了椰子脂肪酸合成途径中FatB1、FatB2及FatB3功能基因在椰子果实生长的第6、7、8、9个月转录水平的变化。其中，FatB1在椰子果实发育过程中转录水平相对稳定，表达升高和降低幅度均较小（图6： A）;FatB2和FatB3基因在果实发育早期转录水平较低，随着果实的发育，表达水平均逐渐升高，尤其是在第9个月，其表达量均达最大（图6 ：B，C）。

3 讨论与结论

椰子作为一种重要的油料作物，与一般的草本油料作物不同。椰子油是国际椰子加工的主要产品，其主要成分为月桂酸，作为食用油，较易被人体吸收，除此之外，椰子油在化妆品和洗涤用品等化工行业也有广泛的用途（Guarte et al.， 1996;Rindengan et al.， 2005）。椰子作为一种月桂酸含量最高的作物，是研究月桂酸等中低碳链脂肪酸合成分子机理的重要材料（肖勇等，2013）。目前，对椰子油脂肪酸相关的研究主要集中在其组成成分及含量的測定与分析，对相关基因表达，功能和调控机制的研究鲜有报道。本研究结合qRT-PCR和GC-MS检测技术，探索椰子果实四个发育时期FatB1、FatB2及FatB3基因的表达量与脂肪酸成分相对含量之间的变化趋势，为将来深入掌握控制中低碳链脂肪酸合成的关键FatB基因及为椰子油中低碳链脂肪酸成分的分子改良提供理论依据。

本研究发现新鲜椰子果肉主要含有9种脂肪酸成分，这与耿薇（2010）的研究结果相一致。Yandeau-Nelson et al.（2011）研究发现FatB1主要是针对C8、C14和C16的脂肪酸合成，FatB2主要针对C14和C16的脂肪酸合成，而FatB3负责产生C12和C14的中碳链脂肪酸。本研究通过分析FatB1、FatB2及FatB3基因的表达量及相对应各生长时期脂肪酸成分相对含量之间的变化趋势，发现在果实发育的第6个月， FatB1表达量达最大，且此时C16和C18脂肪酸的相对含量最高，C12和C14脂肪酸相对含量较低，在第7、8、9个月的FatB1表达量有小幅度下降，但变化相对不大。在果实发育第8、9个月， FatB2和FatB3的表达量逐渐变大，尤其是在第9个月，FatB2和FatB3的表达量均迅速变大，分别为第6个月表达量的4.8倍和27.8倍。 此时，C12和C14的相对含量均达到最大，其中C12为49.9%，是第6个月的4.1倍，C14为20.3%，是第6个月的2.7倍。本研究通过对FatB基因在果肉四个发育阶段的表达进行定量验证，发现FatB1的大量表达与C16和C18脂肪酸的积累相一致，FatB2和FatB3的大量表达与C12和C14中低碳链脂肪酸的积累相一致。这一结果与Yandeau-Nelson et al.（2011）的研究结果存在一定差异。分析其主要原因是脂肪酸的合成是一个由多种酶和多个基因相互协调、共同作用的复杂过程，仅依据脂肪酸的积累和FatB基因的表达变化趋势不能说明FatB基因具体负责哪种脂肪酸的合成，为进一步验证各FatB基因对具体脂肪酸合成的调控功能，可利用分子生物学手段，将关键FatB基因克隆、转化到产油藻中，同时检测转化藻中的脂肪酸成分及含量，来验证其基因功能，从而为椰子油品质的分子改良提供理论支持。

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（责任编辑 李 莉）