改良的兔类风湿性关节炎模型构建与评价

赵卓非，刘 霞，林晓娜，陈 燕，蔡华丽，陈 芸，孙德胜（通讯作者）

（北京大学深圳医院超声影像科 广东 深圳 518036）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种以关节滑膜慢性炎症为特点，进而出现关节软骨和骨破坏以及相关脏器的受累，具有高度致残性的全身性自身免疫性疾病，严重影响人们的生活水平[1-2]。病变关节主要病理表现为炎细胞浸润，滑膜的增生，血管翳形成[3]。因而近年针对RA相关病理生理机制与治疗方法的研究成为热点课题之一。建造接近人类RA的动物模型是各项研究的基础，兔膝关节较大，尺寸与人的手足小关节相近，对指导RA病生理机制与治疗具有很大意义。目前已经建立多种动物模型用于研究RA的病因、发病机制，其中使用佐剂、Ⅱ型胶原等诱导产生的模型最为多见[4]，但诱导使用的致敏剂量与次数并无统一标准，模型成功率多未进行量化报道。本研究通过以卵清蛋白（ovalbumin, OVA）诱导建立兔RA模型，并对模型效果进行评价。

1 资料与方法

1.1 实验材料

动物：健康新西兰兔26只，体质量（2.0±0.5）kg，购自广东省医学实验动物中心（三水基地），动物合格证号：SYXK（粤）2015-0106。

试剂：鸡卵清蛋白（A5503）、完全弗氏佐剂（F5881）采购于Sigma公司；0.9% NaCl溶液、10%甲醛溶液、石蜡、苏木素-伊红染色剂、乙醇溶液、戊巴比妥钠等，由深圳北京大学香港科技大学医学中心提供。

仪器：Mindray Resona 7彩色多普勒超声诊断系统；超低温冰箱（MDY-U53V，SANYO）、显微镜（DP74 PCle，OLYMPUS）、测温计（DM6801A）等，由深圳北京大学香港科技大学医学中心提供。

1.2 实验方法

1.2.1 RA兔模型制作

采用OVA诱导的关节炎模型，分为2次基础致敏和4次局部致敏。以膝关节内同时出现滑膜增厚与关节腔积液为判断模型建立成功的标准。

基础致敏：将OVA用0.9% NaCl稀释后，与完全弗氏佐剂1:1混合，搅拌均匀充分乳化，乳化程度为滴于冰水完全不扩散，配置为浓度4 mg/mL的乳化液。于兔肩胛间区行皮下注射，0.2 mL/部位/次，5个部位共1 mL，注射2次，间隔14d。

局部致敏：将OVA用0.9% NaCl溶液稀释，配置为5 mg/mL的OVA溶液。于第2次基础致敏5 d后，对兔胫骨结节最高点与髌骨下缘连线之中点的髌韧带两侧关节腔内分别注射1 mL，每周1次，连续4周。

对照组不做任何处理。

1.2.2 体征测量

测量兔膝关节表面温度、关节周径与体重。

膝关节表面温度：测量兔髌韧带中点处的关节皮肤表面温度。膝关节周径：测量兔胫骨结节最高点与髌骨下缘连线中点处的关节周径。体重:将兔固定架置于电子秤上，保持安静并记录测值。上述指标均测量3次取平均值，每周测量1次。

1.2.3 多普勒超声测量

于双侧膝关节前侧进行超声测量，记录滑膜厚度、积液深度和血流分级。由2名超声医生分别进行测量，如两者间有较大偏差，则由1名经验丰富的超声医生再次测量，指标测量3次取平均值。

滑膜厚度测量：显示股胫关节正中纵切面，观察并测量滑膜最大厚度。积液深度测量：显示股胫关节正中横切面，观察并测量积液最大深度。血流分级测量：显示股胫关节正中纵切面，观察滑膜血内流情况。按照SZKUDLAREK等[5]评分标准进行半定量分级，共将血流信号分为：0级，无血流信号；Ⅰ级，点状彩色血流信号；Ⅱ级，条状彩色血流信号，充盈面积＜滑膜面积的50%；Ⅲ级，条状丰富彩色血流信号，充盈面积≥滑膜面积的50%。

1.2.4 病理制片制备与病理评分、分级

实验结束后，用耳缘静脉空气栓塞法处死动物。切开双侧膝关节囊，留取滑膜标本。用甲醛固定、常规脱水、浸蜡、包埋、HE染色标本，镜下观察滑膜细胞增生、炎性细胞浸润、滑膜基质活化情况，并根据提出的滑膜炎病理评分标准进行评分[6]，即0分：无滑膜细胞增生、无炎性细胞浸润、无滑膜基质活化；1分：轻度滑膜细胞增生（2～3层细胞，巨细胞罕见）、轻度炎性细胞浸润、轻度滑膜基质活化；2分：中度滑膜细胞增生（4～5层细胞，可见部分巨细胞或淋巴细胞）、中度炎性细胞浸润、中度滑膜基质活化；3分：重度滑膜细胞增生（＞6层细胞，巨细胞常见）、重度炎性细胞浸润、重度滑膜基质活化。总分值：0～3分为1级、4～6分为2级、7～9分为3级。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0统计学软件进行分析。对照组与模型组之间的各项测量指标的比较，符合正态分布计量资料采用（±s）的形式进行统计描述，采用t检验；不符合正态分布的计量资料用M（Q）进行统计描述，采用Kruskal-Wallis检验，检验水准为0.05。

2 结果

2.1 模型建立结果

模型组48例中，44例在致敏后同时出现滑膜增厚与关节腔积液；4例未见滑膜增厚，其中2例同时未见关节腔积液，模型成功率为91.7%（44/48）。

2.2 体征测量

致敏结束，与对照组相比，模型组膝关节表面温度显著上升，膝关节周径增大，统计结果如图1所示。模型组体重减轻（291.3±155.0）g，对照组体重增加（484.6±138.7）g。组间膝关节表面温度变化值与体重变化值差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 组间膝关节表面温度变化值与关节周径变化值统计结果

2.3 多普勒超声测量

从基础致敏开始至局部致敏结束，模型组出现膝关节滑膜增厚（图2A～C），增厚（1.6±0.6）mm，滑膜内可见血流信号（图2A～C），按照SZKUD-LAREK等评分标准，血流分级增加（1.6±0.6）级。对照组膝关节未见明显滑膜或仅见薄条状低回声滑膜组织，滑膜未见明显血流信号（图2D）。模型组膝关节腔可见积液（图3），深度为（4.5±1.8）mm，对照组未见明显关节腔积液。

图2 兔关节炎模型的多普勒超声观察膝关节图像

图3 兔关节炎模型的多普勒超声观察膝关节积液图像

2.4 病理评分与分级

实验结束后，制作膝关节滑膜病理标本，模型组病理评分为（6.5±1.1）分，其中1个关节评为4分，8个关节评为5分，10个关节评为6分，22个关节评为7分，5个关节评为8分，2个关节评为9分。模型组病理分级为（2.6±0.5）级，其中19个关节评为2级，29个关节评为3级。不同病理评分与分级的病理标本图像见图4，膝关节解剖图像见图5。

图4 卵蛋白诱导的兔关节炎模型的病理表现（HE×400）

图5 膝关节解剖图像

对照组中全部病理评分均为0分，病理分级均为0级。

3 讨论

OVA诱导兔RA模型由Dumonde等于1962年首次建立，使用外源性抗原OVA，在兔肩胛间区进行皮下注射与双膝关节腔内注射[7]。通过多次皮下注射外源性抗原，促进机体产生大量抗体，使抗原与抗体沉积于关节滑膜，激活机体的免疫细胞与补体系统，最终产生抗原-抗体-补体免疫复合物，从而诱发关节局部的炎症反应并导致关节肿胀[8]。

本团队在前期的预实验中，参考郑擎等人[9]使用的OVA诱导模型的实验方法，具体步骤为：1 mL OVA 0.9%Nacl溶液（20 mg/mL）行3次基础致敏，每周1次，连续3周；1 mL OVA乳剂（10 mg/mL）行1次局部致敏。Qiu[10]等人的研究显示注入OVA剂量越大，造模成功率越高，当8 mg的OVA注入兔子关节时，造模成功率达100%，但模型数量较少，仅12例。预实验结合上述方法构建3只模型，仅1只出现膝关节滑膜增厚与关节腔积液。

兔RA模型以OVA诱导建立为主，但使用OVA诱导的致敏剂量与次数并无统一标准。除上述两种注射方法外，吴长洁等人[11]使用1 mL OVA与弗氏佐剂乳化液（20 mg/mL），行3次基础致敏，间隔1周；1周后用0.5 mg OVA溶液（10 mg/mL）行1次局部致敏。Liang LS等人[12]使用1 mL OVA 0.9% Nacl溶液（10 mg/mL），行2次基础致敏，间隔2周；再于2周后行1次局部致敏。Rudys R等人[13]使用1 mL OVA 0.9% Nacl溶液（20 mg/mL）行3次基础致敏，间隔2周；再于5天后使用1mL OVA 0.9% Nacl溶液（5 mg/mL）行1次局部致敏。但上述方法构建模型后，未对模型进行评价，实验可重复性未完全阐明。

完全弗氏佐剂乳剂对于抗原的释放较为缓慢，建模过程分为基础致敏与局部致敏相结合，需要不断地对免疫细胞产生刺激作用。不同的致敏剂量与次数构建的模型可能存在一定差异。本实验参考了R.Largo等人的建模方法[14]，增加总致敏次数，即行2次基础致敏与4次局部致敏，并将药物浓度进行改善。致敏后，模型组膝关节表面温度明显增高、体重减轻，超声测量膝关节滑膜增厚，关节腔积液增多、滑膜血流丰富，病理评分≥4分，病理分级≥3级，表明兔RA模型构建成功，48例模型中44例同时出现滑膜增厚与关节腔积液；4例未见滑膜增厚，其中2例同时未见关节腔积液，模型成功率为91.7%（44/48）。未建模成功的4例模型增加一次局部致敏后同时出现滑膜增厚与关节腔积液，表明致敏剂量与次数可能会提高模型的成功率，但耗时将会增加，此模型多适用于兔类大型动物，故需要更多的经费支持；过长的耗时同样存在模型感染、应激等诸多实验风险，故也限制了致敏剂量与次数的延长。

综上所述，使用OVA诱导法建立兔RA模型，通过2次基础致敏与4次局部致敏，可以构建成功率较高的兔类风湿性关节炎模型，可以为类风湿性关节炎后续的相关研究奠定基础。