鸡肠源益生口乳杆菌的分离鉴定与生物学特性

颜世卿 马轲 陈巍

摘要：从鸡肠中分离得到严格厌氧共生菌，筛选出适合禽类生产的益生菌株，探讨其益生性，为其应用奠定基础。通过采集鸡肠黏膜，特定厌氧培养基分离纯化肠道厌氧共生菌。根据抑菌活性筛选得到口乳杆菌，随后，对其进行生物学基本特性分析，包括生长曲线、酸耐受、胆盐耐受、溶血性、细胞毒性分析等。结果显示，口乳杆菌的对数生长期为24～60 h;对酸和胆盐有优良的耐受力;不具有多重耐药性;不具有溶血活性;对小鼠腹腔巨噬细胞细胞系Raw264.7没有细胞毒性;为后续微生态制剂以及抑菌物质研究提供了理论依据。

关键词：鸡肠道;口乳杆菌;分离鉴定;益生性

中图分类号：S852.6 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2021）16-0157-05

动物的肠道中存在着大量而多样的微生物群体，我们将其称为肠道菌群。在这些菌种中，包含大量乳酸菌（LAB），其中乳酸杆菌、双歧杆菌和肠球菌为肠道中的优势菌群。目前所分离得到的乳杆菌种大多来自人和动物的胃肠道，其次是蔬菜及发酵产品[1]。乳酸菌是最重要的微生物之一，可用于食品发酵以及增强发酵食品的口感和质感[2-3]。它们的主要特征是由葡萄糖作为原料生产乳酸、抑制细菌腐败食品和病原体繁殖的生长抑制物质（如细菌素、过氧化氢、二酰基等）[4]。

在某些生产供人类食用的动物的生产系统中，禁止使用许多抗生素，因此在这些系统中，益生菌的使用是重要的工具，不仅可以改善动物健康状况，减少疾病的发生率，而且可以提高生产率和食品质量。LAB是动物肠道菌群的一部分，对健康具有重要作用。实际上，已证明对动物使用LAB可以改善健康状况，提高疾病抵抗力并增强生长和生殖性能[5]。

LAB在动物生产中的用途已得到广泛研究。在家禽生产中，乳酸菌素对生长性能、禽体性状、肠道菌群、血清生化成分、免疫参数和盲肠菌群以及明显的回肠营养消化率具有积极作用。由于某些LAB对病原菌具有抗菌作用，因此它们可以增加禽类对感染的抵抗力，防止不良影响并改善宿主健康。例如：已证明从鸡的直肠样本中提取的片球菌属（Pediococcus sp.）对肠炎沙门氏菌和大肠杆菌具有抗菌活性[6]。

本試验从健康鸡肠道中通过严格厌氧培养分离口乳杆菌菌株，并评价其益生特性，以期为研发鸡用微生态制剂、实现健康养殖奠定理论基础。

1 材料与方法

试验在吉林大学动物医学学院微生物与免疫实验室内进行，试验时间为2019年9月至2021年4月。

1.1 试验动物、菌株与细胞

三黄鸡购自长春市农业科学院，正常饲喂12～16周后用于试验。

本试验所使用的鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大肠杆菌（ Escherichia coli）、单核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）以及小鼠腹腔巨噬细胞系Raw264.7等菌株和细胞由实验室保藏。

1.2 主要试剂

琼脂粉、酵母提取物、胰蛋白、葡萄糖，均购自OXOID公司;脑心浸出液肉汤（BHI）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、MRS肉汤，均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;胎牛血清、绵羊血，均购自Gibco公司（美国）;细菌分离培养用维生素、微量盐，均购自原叶生物有限公司;牛胆盐、浓盐酸溶液，均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 鸡肠共生菌分离培养基（YCFA）配制

BHI培养基18.5 g、酵母提取物5 g、TSB培养基15 g、葡萄糖0.5 g、磷酸氢二钾2.5 g、氯化钯0.33 g、黏蛋白4 g、蒸馏水1 000 mL，固体培养基添加1.5%琼脂，115 ℃高压灭菌30 min，冷却至45 ℃继续加入5%（体积分数）胎牛血清、维生素K3 5 μg、氯化血红素10 μg、微量盐1 mL、D-生物素10 μg、维生素B12 10 μg、吡多胺（维生素B6）100 μg、叶酸（维生素B9）50 μg、L-半胱氨酸盐酸盐-水合物0.6 g即得。

1.4 鸡肠源共生菌分离培养

提前准备YCFA琼脂和液体培养基，置于厌氧培养箱中平衡24 h;将适龄三黄鸡采用急性失血法处死后，剖开腹腔，暴露肠道，用止血钳夹住所需盲肠两端，用手术剪沿止血钳外端剪开，拿出肠段;超净台中，用手术剪剪开盲肠，暴露肠内容物，用手术刀轻柔刮去肠内容物，换刀继续刮取肠黏膜，PBS倍比稀释后，平板划线于YCFA琼脂平板;37 ℃厌氧培养48 h，挑取单菌落至YCFA培养基中继续培养，重复平板划线，直至整个平板菌落单一。

1.5 分离菌株的鉴定

选取菌落单一的菌株，培养至对数生长期，将菌液送往吉林省库美生物科技有限公司进行16S rRNA测序，所得序列通过NCBI BLAST，同GenBank数据库中已知菌株序列进行比对，确定菌株种属。

1.6 抑菌活性菌株的检测

将培养48 h的共生菌扩增菌液8 000 r/min，4 ℃ 离心10 min，上清用0.22 μm滤膜过滤得到无细胞发酵液，将培养好的指示菌鼠伤寒沙门菌按1%（体积分数）接种至相应40 ℃高压灭菌后的琼脂培养基中，轻柔并迅速混合均匀后倒板，待琼脂培养基凝固后，在表面放置牛津杯，每个牛津杯内加入 200 μL 上述无细胞发酵液，在生物洁净工作台中扩散3 h后，37 ℃培养9 h，检测是否有抑菌圈出现，并用游标卡尺测量抑菌圈直径。

1.7 口乳杆菌抑菌活性检测

采用牛津杯琼脂扩散法检测口乳杆菌Y62的抑菌活性。首先将10 mL 2%琼脂倾倒在灭菌平板上，待其凝固后，加入含有100 μL指示菌悬液的相应指示菌琼脂培养基10 mL，待凝固后，以无菌操作在培养基表面垂直加入牛津杯，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，在杯中加入Y62的CFS 200 μL，每组重复3次，37 ℃培养12～18 h。测定抑菌圈直径。

1.8 口乳杆菌的生长曲线测定

提前准备MRS培养基和平板，置于厌氧培养箱中平衡24 h，并测定MRS培养基pH值;挑取MRS琼脂上的口乳杆菌Y62单菌落于MRS培养基中，37 ℃ 厌氧培养48 h;调节菌液浓度至对数生长期（D600 nm为0.8～1.2）;将菌液按1%（体积分数）接种量接种至预平衡的MRS培养基中，37 ℃厌氧培养;每 12 h 吸取1 mL菌液，检测其D600 nm并涂布平板;根据D600 nm值和平板菌落计数绘制生长曲线。

1.9 口乳杆菌的酸耐受、胆盐耐受检测

用1 mol/L盐酸将MRS液体培养基的pH值分别调节至2、3、4、5、6;另向MRS液体培养基中加入0.1%、0.2%和0.3%的牛胆盐;将Y62菌株活化2代后，以1%（体积分数）接种量接种于MRS液体培养基中，37 ℃厌氧培养至对数生长期;离心收集细菌;将Y62调整至所需浓度，将菌体重新悬浮于不同pH值以及含牛胆盐的MRS液体培养基中，37 ℃厌氧培养3 h;采用平板涂布法计算在不同条件MRS培养基中培养0 h和3 h的活菌数量，试验重复3次;存活率计算：存活率=N1/N0×100%，式中：N1表示3 h测定的活菌数，lg CFU/mL;N0表示0 h测定的活菌数，lg CFU/mL[7]。

1.10 口乳杆菌的药物敏感性检测

提前准备MRS培养基和平板，置于厌氧培养箱中平衡24 h;取保藏的Y62菌株，活化2代后接种至MRS培养基中，37 ℃厌氧培养至对数生长期;离心收集细菌;将Y62调整至0.5麦氏单位浓度，50 μL 涂布平板;夹取药敏纸片平放在含菌平板上，每个平板放置6种药敏片;37 ℃厌氧培养16～24 h;质控菌株为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）USA300_TCH1516;观察并测量Y62抑菌圈直径，并参照美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute）推荐的纸片扩散法标准进行判定。

1.11 口乳杆菌的溶血性检测

配制100 mL BHI琼脂，加入7 mL新鲜灭菌綿羊血，倒板，4 ℃保存备用;向血平板上滴加10 μL浓度为108 CFU/mL的口乳杆菌Y62，对照组滴加10 μL相同浓度的金黄色葡萄球菌;37 ℃厌氧培养48 h;观察血平板，接种物周围的半透明光环表明存在溶血活性。

1.12 口乳杆菌的细胞毒性检测

取保存的Raw264.7细胞传代3次后消化，按 1×105 cell/well接种至96孔细胞培养板，正常培养12 h;轻柔吸弃细胞培养基，PBS清洗2次后，加入不含双抗的DMEM 90 μL，再加入调整好浓度的Y62菌液10 μL，对照组加入10 μL MRS液体培养基;4 ℃、1 000 r/min水平离心2 min，37 ℃ CO2培养箱培养;6、24 h对细胞通过CCK-8试剂盒检测存活率。

1.13 数据分析

应用GraphPad Prism 6.0分析软件，并采用Multiple t test对研究数据进行分析统计。

2 结果与分析

2.1 分离培养结果

本试验共分离培养共生菌菌株41株，分属于乳杆菌属、肠球菌属、螺杆菌属、普雷沃菌属、芽孢杆菌属等5个属11个种，具体种类见表1。

2.2 抑菌活性检测结果

分离菌株的抑菌活性检测如图1所示，共有5株共生菌对铜绿假单胞菌有抑菌活性，其中Y62抑菌活性最好，抑菌圈直径达20.7 mm，因此选择Y62作为候选菌株进行后续研究。

2.3 口乳杆菌Y62抑菌活性检测结果

由图2可见，口乳杆菌Y62对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌以及单增李斯特菌均具有一定的抑菌活性，对金黄色葡萄球菌没有抑菌活性。

2.4 口乳杆菌的生长曲线测定结果

根据口乳杆菌Y62的生长曲线（图3）显示，该菌株对数生长期为6～24 h;稳定期为24～60 h;60 h 后进入衰亡期。

2.5 口乳杆菌的酸耐受、胆盐耐受结果

口乳杆菌Y62的酸耐受结果见表2，菌株在pH值≥3环境内3 h后存活率均大于95%，在pH值=2环境内3 h存活率为69.8%。胆盐耐受结果如表3所示。

2.6 口乳杆菌的药物敏感性检测结果

试验所用质控菌株所产抑菌圈直径在质控范围内，证明本试验所用药品合格，口乳杆菌Y62对不同抗生素的耐药性结果见表4。口乳杆菌Y62对所检测的大环内酯类抗生素（红霉素、麦迪霉素）表现出100%的敏感率，对喹诺酮类抗生素（氧氟沙星、环丙沙星）表现出100%的敏感率，对β-内酰胺类抗生素（青霉素类、头孢类）表现出78%的敏感率，对氨基糖苷类抗生素（庆大霉素、卡那霉素）表现出耐药。

2.7 口乳杆菌的溶血性检测结果溶血结果

由图4可见，阳性对照显示溶血性，口乳杆菌Y62不具有溶血活性。

2.8 口乳杆菌的细胞毒性检测结果

细胞毒性检测如图5所示，口乳杆菌Y62在MOI=100时作用24 h，细胞无死亡，与培养基对照组无差异，证明其不具有细胞毒性。

3 讨论

本试验的目的在于分离来自鸡肠道的共生菌，并找寻其中潜在的抑菌益生菌。健康禽类肠道分布着超过300种细菌，其中约有半数为厌氧或兼性厌氧菌，对这些细菌的分离鉴定具有较为重要的意义。乳酸菌是肠道中的优势菌群 本次试验结果也证实了这点，本次分离的41株共生菌中，乳酸菌共有31株，占比75.61%，而这些乳酸菌中，乳杆菌28株，占比90.32%，其中口乳杆菌仅1株。作为鸡肠道中的主要乳杆菌种，本次仅分离出1株，其一可能是由于口乳杆菌主要分布在十二指肠、空肠区域，在盲肠的含量较低[8]。其二可能是在分离纯化过程中，菌群的多样性发生了变化，部分共生菌无法分离得到活菌。通过本研究分离得到的口乳杆菌，表明本研究所采取的以盲肠黏膜为来源，对不易培养共生菌进行分离纯化的方法和路线是有效的，在有限的条件下可以进一步推广应用。

口乳杆菌Y62作为鸡肠道共生菌，其定植的必要条件是耐受胃肠环境，本研究的结果也证实这点。该菌对酸有较强耐受能力，在pH值=3的条件下培养3 h，存活率几乎等于100%，在pH值=2条件下培养3 h，存活率依然高于70%，但是其对胆盐的耐受能力较弱，在0.3%胆盐浓度下，存活率为70.3%，低于其他乳酸杆菌，这可能是不同种属间具有差异性导致，与先前的研究[9]相符合。

从鸡肠道中分离得到的共生菌，为了后续培养以及益生性评价，对其耐药性进行评价是十分必要的。本试验中口乳杆菌Y62对市面上的大部分抗生素均敏感，仅对氨基糖苷类抗生素表现耐药，无多重耐药性。并且有研究表明，乳酸菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性表现出较大属间差异，乳球菌属、链球菌属等对其无耐药性，乳杆菌属对其表现出较高的耐药性[10]，本试验的结果与之相符合。

肠道共生菌群除益生菌外，还有条件致病菌和致病菌，所以对口乳杆菌Y62的安全性进行评价非常重要。因为口乳杆菌Y62是从健康鸡的肠道中分离，故安全性评价并未进行动物试验，细胞試验结果证实了它的安全性，对于未来在食品、医药或畜牧行业的应用是安全的。

本试验结果表明，分离得到的严格厌氧口乳杆菌具有优良益生菌的益生特性，作为鸡源益生菌具有较好的应用前景。

参考文献：

[1]de Vuyst L，Leroy F. Bacteriocins from lactic acid bacteria：production，purification，and food applications[J]. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology，2007，13（4）：194-199.

[2]van Geel-Schutten G H，Flesch F，ten Brink B，et al. Screening and characterization of Lactobacillus strains producing large amounts of exopolysaccharides[J]. Applied Microbiology&Biotechnology，50（6）：697-703.

[3]Hati S，Mandal S，Prajapati J B. Novel starters for value added fermented dairy products[J]. Current Research in Nutrition and Food Science Journal，2013，1（1）：83-91.

[4]Alakomi H L，Skytt E，Saarela M，et al. Lactic acid permeabilizes gram-negative bacteria by disrupting the outer membrane[J]. Applied and Environmental Microbiology，2000，66（5）：2001-2005.

[5]Yeoman C J，White B A. Gastrointestinal tract microbiota and probiotics in production animals[J]. Annual Review of Animal Biosciences，2014，2：469-486.

[6]Noohi N，Ebrahimipour G，Rohani M，et al. Evaluation of potential probiotic characteristics and antibacterial effects of strains of Pediococcus species isolated from broiler chickens[J]. British Poultry Science，2016，57（3）：317-323.

[7]石春卫，谢 静，杨桂连，等. 猪源粪肠球菌的分离与鉴定[J]. 动物医学进展，2020，41（9）：123-127.

[8]Wang L，Fang M J，Hu Y P，et al. Characterization of the most abundant Lactobacillus species in chicken gastrointestinal tract and potential use as probiotics for genetic engineering[J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica，2014，46（7）：612-619.

[9]Liong M T，Shah N P. Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability of Lactobacilli strains[J]. Journal of Dairy Science，2005，88（1）：55-66.

[10]Gad G F M，Abdel A M，Farag Z S H. Antibiotic resistance in lactic acid bacteria isolated from some pharmaceutical and dairy products[J]. Brazilian Journal of Microbiology，2014，45（1）：25-33.