饥饿胁迫对猛虾蛄不同组织免疫酶活性的影响*

赵旺，温为庚，谭春明，黄星美，杨蕊，陈明强，杨其彬，陈旭

1. 中国水产科学研究院南海水产研究所/热带水产研究开发中心/三亚热带水产研究院，海南三亚 572018

2. 农业农村部南海渔业资源开发利用重点试验室，广东广州 510300

虾蛄Oratosquilla oratoria属节肢动物门Arthrop⁃oda 软甲纲Malacostraca 口足目Stomatopoda 虾蛄科Squillidae，俗称“濑尿虾”“螳螂虾”“虾爬子”和“富贵虾”等，其生活的底质以泥底或沙泥底为主。广泛分布于印度尼西亚、马来西亚、日本、中国东南沿海及台湾地区海域等，地中海沿岸和墨西哥湾也有分布［1-6］。猛虾蛄Harpiosquilla harpax的体形较大、可食部分多，又因其肉质鲜美、营养丰富，深受消费者喜爱［7］。随着人们生活水平的提高，猛虾蛄的市场需求不断增加，虾蛄资源的开发利用变得日益突出。

当环境因子和进食量发生改变后，水生生物发生应激反应，自身的免疫受到影响，对病原菌的感染提高，从而导致疾病的爆发。水生动物容易受环境和饥饿的胁迫，它们通过改变自身各种酶的活性来调节代谢水平、能量分配和能源物质消耗，应对胁迫，以维持生理活动。饥饿是水生动物常遇的胁迫因子，也是国内外学者研究的热点课题。学者报道：饥饿影响刀鲚Coilia nasus、卵形鲳鯵Trachinotus ovatus等鱼类体成分、器官组织、抗氧化生理生化指标［8-11］，也影响贝类［12-13］以及刺参Apostichopus japonicus［14］和克氏原螯虾Procambarus clarkii［15］消化酶和免疫酶活性。长时间饥饿，虎斑乌贼Sepia pharaonis体质量和肝体比显著下降［16］。周元雪［17］通过不同饥饿时间对口虾蛄免疫活性的影响，研究表明，随着饥饿时间的增加，磷酸酶活力一直减小，而过氧化氢酶、溶菌酶、过氧化物歧化酶活力表现为先增后减的趋势。猛虾蛄Harpiosquilla harpax是北部湾的优势种类，夏季平均资源密度高达209.83 kg/km2［18］，本研究可为猛虾蛄饥饿胁迫实验提供研究参考，同时也为进一步优化猛虾蛄的养殖模式提供一定的数据支撑。

本文以猛虾蛄为研究对象，通过饥饿胁迫实验，分析饥饿对猛虾蛄体内六种免疫酶活力的影响。为研究猛虾蛄在逆境胁迫条件下代谢调节机制提供参考。同时，有利于更好地了解猛虾蛄的逆境调节机制，为提高猛虾蛄养殖存活率和丰富其养殖生态学理论提供支持。

1 材料和方法

1.1 实验材料

猛虾蛄购买自海南省陵水县新村渔港（海南省陵水黎族自治县），共166尾，用厚尼龙袋加水、充氧气并扎口，运送至实验基地。实验所用猛虾蛄的平均体质量为（48.39±0.5）g/尾，体长14.5～15.8 cm，体宽2.4～3.1 cm。实验前，先用沙滤海水暂养7 d，密度10 尾/m2，用体质量6～10 g 的鲜活凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei，剪去头胸甲和尾尖部分，每天过量投喂2 次（6：00，19：00），2 h 后清除残饵。猛虾蛄养殖过程中水质参数：温度（26.5±1.0）℃，pH 8.0±0.2，盐度（33±0.6）‰，溶氧大于6.8 mg/L，氨氮质量浓度小于0.01 mg/L，亚硝酸盐质量浓度小于0.03 mg/L，每日换水1 次，每次换水50%。

1.2 实验方法

1.2.1 实验设计选取暂养后活泼健康、附肢完整的猛虾蛄120 尾，随机投放，每个池子2 尾，连续充气。实验水池为60 个室内小水泥池（长80 cm、宽80 cm、水深100 cm）。养殖条件与暂养条件相同，暂养结束后，全部统一停止投喂。分别在饥饿条件下处理1、6、11、21 d 后取样，每次随机取6～10 尾虾蛄，发现有虾蛄死亡的池子作废。取样时，先剪掉掠足，滤纸吸干水分。用1 mL 注射器从靠近尾节处斜插入围心管抽取血液于离心管中，剪开背部甲壳，从尾部宽阔部位剪取肌肉0.5 g，分离出肠道和肝胰脏，置离心管中，所有操作在冰面进行，样品-20 ℃保存。

1.2.2 样品处理将各组所取样品称量体质量后，按1∶2（m∶v）的比例与0.2 mol/L 生理盐水进行混合、研磨，研磨液于4 ℃、4 000 r/min 离心10 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱保存待测，总蛋白和各免疫酶活力分别采用相关试剂盒进行测定（购买自：南京建成生物工程研究所）。每组样品平行测定3次。

1.2.3 数据处理本论文中数据采用Mean ±SD 表达，实验数据经Excel 2010 初步整理后，用SPSS 21.3 进行统计分析，先对数据作单因素方差分析（ANOVA），若处理间有显著差异，再用Duncan 法比较均值间的差异显著性（P< 0.05）。

2 实验结果

2.1 饥饿胁迫对猛虾蛄过氧化氢酶活力的影响

饥饿胁迫对猛虾蛄过氧化氢酶（CAT）活力的影响见图1。实验结果表明，除饥饿5 d 时血液的CAT 活力变化不显著外，不同饥饿时间对猛虾蛄各组织CAT 活力的影响显著（P< 0.05）。饥饿胁迫对肠道和肌肉组织CAT 活力的影响较为一致，均在第10 天酶活力最高；血液内CAT 活力随饥饿时间的延长呈现“先增后降再增”的变化趋势，而且波动幅度较大，在饥饿胁迫第10 天出现最低值31.82 U/g，并在第20 天时CAT 活力最大达118.79 U/g；而饥饿胁迫对肝胰腺CAT 活力的影响却随着饥饿时间呈现逐渐下降趋势，在饥饿胁迫第20天降至16.69 U/g。

图1 饥饿胁迫对猛虾蛄CAT活力的影响字母（a～d）不同表示二者之间存在显著性差异，下标数字1～4分别代表血液、肠道、肝胰腺和肌肉组织4组样品Fig.1 Effect of starvation stress on CAT activities of H. harpax Different letters(a-d)mean that there is a significant difference between the two groups,and the subscript numbers 1-4 repre⁃sent the samples of blood,intestine,hepatopancreas and muscle tissue,respectively

2.2 饥饿胁迫对猛虾蛄酸性磷酸酶活力的影响

饥饿胁迫对猛虾蛄酸性磷酸酶（ACP）活力的影响见图2。实验结果表明，不同饥饿时间对猛虾蛄血液、肠道和肝胰腺ACP 活力的影响存在差异，而对肌肉组织ACP 活力不存在显著变化（P>0.05）。其中，饥饿胁迫对肠道和肝胰腺ACP 活力的影响相一致，表现为“先增后降”的变化趋势，均在饥饿胁迫第5 天时ACP 活力最大，分别为333.43 和335.57 U/g；血液内ACP 活力随饥饿时间的延长同样呈现“先增后降”的变化趋势，但是仅在饥饿胁迫第10天出现显著变化。

图2 饥饿胁迫对猛虾蛄ACP活力的影响字母（a～d）不同表示二者之间存在显著性差异，下标数字1～4分别代表血液、肠道、肝胰腺和肌肉组织4组样品Fig.2 Effect of starvation stress on ACP activities of H. harpax Different letters(a-d)mean that there is a significant difference between the two groups,and the subscript numbers 1-4 represent the samples of blood,intestine,hepatopancreas and muscle tissue,respectively

2.3 饥饿胁迫对猛虾蛄碱性磷酸酶活力的影响

饥饿胁迫对猛虾蛄碱性磷酸酶（AKP）活力的影响见图3。实验结果与酸性磷酸酶活力的变化趋势相似，猛虾蛄血液、肠道和肝胰腺AKP 活力随饥饿时间不同而变化，部分时间里达到显著性变化（P< 0.05）。饥饿胁迫对肠道和肝胰腺AKP 活力的影响均表现为“先增后降”的变化趋势，并在饥饿胁迫第5 天时AKP 活力最大，分别为614.49 和251.97 U/g；血液内AKP 活力随饥饿时间的延长同样呈现“先增后降”的变化趋势，但酶活力最大值出现在饥饿胁迫第10 天。然而，肌肉组织AKP 活力一直处在较低值且其随饥饿胁迫的影响变化不明显。

图3 饥饿胁迫对猛虾蛄AKP活力的影响字母（a～d）不同表示二者之间存在显著性差异，下标数字1～4分别代表血液、肠道、肝胰腺和肌肉组织4组样品Fig.3 Effect of starvation stress on AKP activities of H. harpax Different letters(a-d)mean that there is a significant difference between the two groups,and the subscript numbers 1-4 repre⁃sent the samples of blood,intestine,hepatopancreas and muscle tissue,respectively

2.4 饥饿胁迫对猛虾蛄总超氧化物歧化酶活力的影响

饥饿胁迫对猛虾蛄总超氧化物歧化酶（T-SOD） 活力的影响见图4。实验结果表明，饥饿时间可影响猛虾蛄各组织T-SOD 活力，甚至达到显著水平（P< 0.05），且各组织T-SOD 酶活力呈现相似的变化规律，表现为“先增后降”的变化趋势；在饥饿胁迫第10天时猛虾蛄体内血液、肠道、肝胰腺和肌肉组织的T-SOD 活力与未饥饿胁迫（0 d）相比分别从24.16 、46.35 、42.06 、34.04 U/mg 提 高 到41.18 、104.76 、57.03 和67.27 U/mg。但是，随着饥饿时间的延长，T-SOD活力在饥饿胁迫第20天均有所下降。

图4 饥饿胁迫对猛虾蛄T-SOD活力的影响字母（a～d）不同表示二者之间存在显著性差异，下标数字1～4分别代表血液、肠道、肝胰腺和肌肉组织4组样品Fig.4 Effect of starvation stress on T-SOD activities of H. harpax Different letters(a-d)mean that there is a significant difference between the two groups,and the subscript numbers 1-4 repre⁃sent the samples of blood,intestine,hepatopancreas and muscle tissue,respectively

2.5 饥饿胁迫对猛虾蛄谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响

饥饿胁迫对猛虾蛄谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活力的影响见图5。实验结果表明，不同饥饿时间猛虾蛄GSH-PX活力不同，甚至发生显著性变化（P< 0.05）。其中，饥饿胁迫对血液和肠道GSH-PX活力的影响较为一致，均呈现“先增后降”的变化趋势并在饥饿第10 天酶活力显著增高，分别达374.47 和501.35 U/mg；而肝胰腺内GSH-PX 活力随饥饿时间的延长却呈现“先减后增”的变化趋势，在饥饿胁迫第10 天时GSH-PX活力出现最低值33.60 U/mg；而饥饿胁迫对肌肉组织GSH-PX活力的影响较小。

图5 饥饿胁迫对猛虾蛄GSH-PX活力的影响字母（a～d）不同表示二者之间存在显著性差异，下标数字1～4分别代表血液、肠道、肝胰腺和肌肉组织4组样品Fig.5 Effect of starvation stress on GSH-PX activities of H. harpax Different letters(a-d)mean that there is a significant difference between the two groups,and the subscript numbers 1-4 repre⁃sent the samples of blood,intestine,hepatopancreas and muscle tissue,respectively

2.6 饥饿胁迫对猛虾蛄过氧化物酶活力的影响

饥饿胁迫对猛虾蛄过氧化物酶（POD）活力的影响见图6。实验结果表明，不同饥饿时间猛虾蛄血液和肠道内POD 活力存在差异，部分饥饿时间里达到显著差异（P< 0.05），而对肝胰腺和肌肉组织内POD 活力影响却不显著（P>0.05）。并且，随着饥饿时间的延长，血液内POD 活力逐渐升高，在第20 天时酶活力最高达64.71 U/mg；肠道内POD 活力随饥饿时间的延长呈现“先增后降”的变化趋势，在饥饿胁迫第10 天时POD 活力最大为25.39 U/mg。

图6 饥饿胁迫对猛虾蛄POD活力的影响字母（a～d）不同表示二者之间存在显著性差异，下标数字1～4分别代表血液、肠道、肝胰腺和肌肉组织4组样品Fig.6 Effect of starvation stress on POD activities of H. harpax Different letters(a-d)mean that there is a significant difference between the two groups,and the subscript numbers 1-4 repre⁃sent the samples of blood,intestine,hepatopancreas and muscle tissue,respectively

3 讨 论

水生动物在饥饿状态时，主要是通过改变身体各种酶的活性来调节代谢水平、能量分配和能源物质消耗，以适应食物缺乏造成的胁迫，维持机体正常生理活动。而机体非特异性免疫系统在应对逆环境应激时起主导作用，其中过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）过氧化物酶（POD）、以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX） 等在免疫调节过程中变化明显［19-21］；当在饥饿胁迫状态时，先通过消耗自身储存的营养物质，同时降低自身酶活性，调节免疫因子活性以此维持生理活动［22-23］。

3.1 饥饿胁迫对猛虾蛄过氧化氢酶活力的影响

CAT 可以将机体产生的H2O2分解成无毒、无害的H2O 和O2，而细胞内CAT 的底物H2O2浓度大量增加时CAT 活性便会被诱导［24］。本实验中，肠道和肌肉组织内CAT 活性随饥饿时间的延长呈现“先增后降”，表明轻度饥饿胁迫对虾蛄肠道和肌肉组织内CAT 活性有不同程度诱导作用，而重度胁迫下这种诱导作用会被抑制［25］。饥饿胁迫下肝胰腺内CAT 活力随着时间的延长逐渐降低，这可能是机体超氧阴离子自由基在SOD 的作用下被还原为H2O2的含量下降，致使相应CAT 活性降低［10，22］。

3.2 饥饿胁迫对猛虾蛄酸性磷酸酶活力的影响

ACP 是一种重要的水解酶，在体内直接参与磷酸基团的转移和代谢，除了在血细胞内起作用外，还可以分布于血清中形成水解酶体系［21］。在本实验条件下，饥饿胁迫对肠道和肝胰腺内ACP活力的影响均表现为“先增后降”的变化趋势，并在饥饿胁迫第5 天时ACP 活力最大，之后显著下降，故可认为短期饥饿胁迫可诱导虾蛄抗氧化能力，而长期饥饿可导致虾蛄免疫能力降低。研究指出，饥饿胁迫后由于体内能量的消耗，机体免疫力降低，对体内ACP 活性有重要的影响，机体内ACP活性随着饥饿时间延长逐渐下降［12，14］。

3.3 饥饿胁迫对猛虾蛄碱性磷酸酶活力的影响

AKP 是机体对新陈代谢进行调节以保护自身的另一重要调节酶，通过寡糖磷脂酰肌醇锚定在细胞膜上的结合蛋白，在生物体可直接参与磷酸基团的转移和代谢，且参与体内钙、磷代谢［26-27］。水产动物处于不利环境，如金属或有机物污染、饥饿等，其碱性磷酸酶活性便发生变化［26，28］。本研究发现，饥饿胁迫对血液、肠道和肝胰腺AKP活力的影响均表现为“先增后降”的变化趋势，并分别在饥饿胁迫第5 天和第10 天时AKP 活力最大，可见短期饥饿胁迫诱导了其代谢，而随着饥饿时间的延长其碱性磷酸酶活性下降使组织细胞生理活动维持在较低的水平以适应饥饿胁迫。

3.4 饥饿胁迫对猛虾蛄总超氧化物歧化酶活力的影响

SOD 是一种重要的清除体内超氧化阴离子自由基的抗氧化酶，减少机体过氧化损伤，其活性随自由基浓度的变化而变化［29］。正常情况下，生物机体内SOD 的水平较为稳定，但机体处于饥饿等外部胁迫状态下，其抗氧化能力会随着外界环境和机体免疫能力的变化而变化［10］。本实验中，各组织酶活力呈现相一致的变化规律，均表现为“先增后降”的变化趋势且在饥饿胁迫第10 天时T-SOD 活力最高。实验结果与现有很多研究是相一致的，如饥饿25 d 方斑东方螺机体SOD 活性增强，40 d 却会导致SOD 活性下降［30］；褐牙鲆在2 d的饥饿胁迫下SOD 活性显著增加，而饥饿20 d 后其SOD 活性显著下降［31］。为此，作者推测虾蛄在食物不足时，超氧阴离子的高低能够反映出虾免疫机能的好坏［32］，机体为应对饥饿胁迫而产生积极的免疫防御，迫使SOD 活性增强以维持体内氧化系统的平衡，但长时间饥饿状态下，机体的能量会被消耗，致使SOD活性降低。

3.5 饥饿胁迫对猛虾蛄谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响

GSH-PX 是一类广泛存在于动植物和微生物中既能催化还原有机过氧化物，又能催化还原无机过氧化物的抗氧化酶，构成机体抵抗氧化应激的第一道屏障［33］。实验结束时，血液和肠道GSHPX 活力均呈现“先增后降”的变化趋势并在饥饿第10 天酶活力显著增高，说明在饥饿初期机体产生积极的抗氧化防御，然而随着能量的严重不足致使体内免疫酶活性下降［21］；然而，肝胰腺内GSH-PX 活力却随饥饿时间的延长却呈现“先减后增”的变化趋势，表明肝胰腺GSH-PX活性发生了与饥饿胁迫相适应的变化，并且短期饥饿对猛虾蛄造成的氧化应激损伤可逆［11］。

3.6 饥饿胁迫对猛虾蛄过氧化物酶活力的影响

POD 以H2O2为电子受体，直接催化酚类或胺类化合物氧化的酶。本文肠道内POD 活力随饥饿时间延长呈现“先增后降”的变化趋势，在饥饿胁迫第10天时POD活力最大，这与谭春明等［34］在研究氨氮对东风螺体内POD 活性影响时的结果一致。体内免疫酶活力的下降可能是长时间在饥饿胁迫下，机体抗氧化体系不能及时清除自由基，其氧化与抗氧化平衡被破坏［35-36］。但随着饥饿时间延长，血液内POD 活力逐渐升高，这可能是饥饿胁迫对各组织的影响程度及适应能力不同所致。

4 结 论

养殖过程中饥饿胁迫会对猛虾蛄免疫酶活性产生较大的影响。研究表明，饥饿时间对猛虾蛄各免疫酶活力均有显著的影响（P< 0.05），但各组织的影响程度不同，当猛虾蛄受到轻度饥饿胁迫时，肠道内CAT、ACP、AKP、T-SOD、GSHPX 和POD 活性被诱导，而受重度饥饿胁迫时其活性则被抑制；其他组织各免疫酶活性同样有类似的规律，但是存在一定差异性。