异丙甲草胺对水生生物的毒性效应研究进展

彭中校，张华威，黄会，宫向红，张秀珍*

(1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.山东省海洋资源与环境研究院，山东 烟台 264006)

随着现代农业的发展，除草剂已成为农业生产中广泛使用的一类农药。由于大量的使用，除草剂不可避免地残留于周围环境如土壤、水体中，对环境、农作物和非靶标生物造成一定的污染，对人体健康存在潜在的危害[1]。异丙甲草胺是一种酰胺类选择性除草剂，其分子式为C15H22ClNO2，有4种光学异构体，分别为aS,1S-、aR,1S-、aR,1R-和aS,1R-(图1)。目前市面上常见的异丙甲草胺商品化产品有2种，一种为外消旋异丙甲草胺(Rac-metolachlor)，又称都尔，另一种为富集了S对映体的S-异丙甲草胺(S-metolachlor)(图2)，又称精异丙甲草胺[2]。因异丙甲草胺具有广谱、高效、选择性强等特点，该农药被广泛应用于旱地作物、蔬菜作物、果园[3]和水稻移栽田等。异丙甲草胺可溶于水(在pH 7.3和25 ℃时溶解度为480 mg/L)，降解缓慢，在pH 1～9和25 ℃下半衰期超过200 d[4]，施药后的活性持续时间较长，可达10～12周[5]。农药在田间使用后,只有少量停留在作物上发生效用,大部分则残留在土壤或漂浮于大气中,通过降雨、淋溶等途径进入水体,从而污染水生生态环境的质量,影响水生生态系统的结构和功能[6]。

图1 异丙甲草胺的4种光学异构体[2]Fig.1 Four optical isomers of metolachlor

图2 异丙甲草胺的对映体结构图[8]Fig.2 Enantiomer structure diagram of metolachlor

异丙甲草胺作为除草剂已使用多时，海洋环境与海洋生物面临着被其污染的风险，进而通过食物链影响人类健康，但国内相关的环保法律法规尚未完善，因此异丙甲草胺成为一种新型污染物。近十年来，关于异丙甲草胺的生态风险以及对水产品质量安全的影响成为一个研究热点。除草剂胁迫对海洋生物的影响是多方面的。当生物体受到外源物胁迫时，机体为维持自身正常生长以及内环境稳态，而调整各种生理生化活动，包括生长、发育、繁殖以及各种生理活动都会发生变化，且这种变化会贯穿整个胁迫过程。当胁迫时间延长或外源物剂量增大时，生物体的这种自我调节能力便不能使机体保持稳态，因此产生毒性效应。本研究综述了异丙甲草胺对水生动物与植物的毒性效应，主要包括对水生生物急性毒性、生长发育毒性及生理毒性等，揭示异丙甲草胺污染对水产品质量安全的影响，为分析异丙甲草胺污染对生态环境的健康风险评估、完善相关环境保护制度提供参考。

1 酰胺类除草剂概况

1.1 酰胺类除草剂的分类

在众多除草剂中，酰胺类除草剂使用量较大，在全球农药市场排第9位，在除草剂中排第4位[9]。酰胺类除草剂根据化学结构和生理活性的不同，分为芳酰胺类和氯代乙酰胺类。氯代乙酰胺类除草剂主要包括甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺和异丙甲草胺等，用于芽前土壤处理，防除禾本科杂草[10-11]。

1.2 酰胺类除草剂污染、残留状况

除草剂的大量使用，已引起科研人员对除草剂在自然环境下的污染、残留状况的广泛关注。国内已有研究报道酰胺类除草剂在稻田、池塘等养殖环境中残留情况，如在东北稻田养殖中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)样品中检出丁草胺和乙草胺[12];在哈尔滨市郊区的淡水养殖池塘的水体、底泥以及土壤中，乙草胺、丙草胺和丁草胺的检出率为100 %[13]。国外的研究报道中，美国地质调查局(USGS)[14]、瑞典[15]、印度[16]的学者也报道了当地水产品或者水体样本的酰胺类除草剂检出情况。关于酰胺类除草剂的环境行为研究表明，此类除草剂在自然界中的半衰期较长，如甲草胺在地表水的半衰期为808～1 518 d[17]，乙草胺和丁草胺的水解半衰期分别为2 310 d、1 155 d[18]。

1.3 酰胺类除草剂毒性概况

国内外学者对酰胺类除草剂的大量使用而表现出来的毒害作用已有不少的研究。酰胺类除草剂对水生动物毒性主要表现为致畸、致死及影响酶活性等，对水生植物的毒性主要表现为降低植物细胞生物量、干扰细胞分裂等。斑马鱼(Brachydanioreriovar)经苯酰草胺处理后，红细胞微核细胞率明显高于对照组[19]。金鱼(Carassiusauratus)在浓度1.5 mL/L和2.0 mL/L的丁草胺中，血清过氧化物酶和酯酶活性降低或消失，酶活性与丁草胺浓度存在剂量-效应关系[20]。低浓度的乙草胺和丁草胺对浮萍(Lemna)过氧化物酶活性表现为激活作用，高浓度时表现为抑制作用[21]。丁草胺不仅抑制青萍(Lemnaminor)生长，同时也损伤青萍叶片，降低其细胞叶绿素含量[22]。3.4 mg/L 丙草胺从原肠胚中期处理大鳞副泥鳅[Paramisgurnusdabryanus(Sauvage)]胚胎，其孵化率降至 48.40%，丙草胺对泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)幼鱼的96 h半致死浓度(LC50)为0.401 97 mg/L，对大鳞副泥鳅幼鱼的96 h LC50为0.326 50 mg/L[23]。另外，属于同一类型的不同除草剂对于同一物种的毒性呈现出差异性，如对斑马鱼成鱼，丁草胺属极高毒类除草剂[24-25]，乙草胺、甲草胺、丙草胺以及异丙甲草胺属中毒类除草剂[26]。同一种除草剂对映体则表现出选择性差异，如S-异丙甲草胺和Rac-异丙甲草胺对斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)、普通核小球藻(Chlorellavulgaris)和水稻的毒性效应表现出明显差异性[2]。

由以上所述可知，酰胺类除草剂对水生生物的毒性效应是多方面的，以下将从异丙甲草胺对水生生物的生长发育、免疫调节、基因表达和氧化应激等方面进行综述。

2 异丙甲草胺对水生生物的毒性效应

2.1 异丙甲草胺对水生植物的毒性

2.1.1 急性毒性

与水生动物相比，水生植物在受到除草剂胁迫时其敏感性更强，因此研究异丙甲草胺对水生植物的急性毒性，进行毒性分级，为后续亚慢性和慢性毒性试验提供线索，为相关环保措施的制定提供参考。Rac-及S-异丙甲草胺对斜生栅藻和普通核小球藻的96 h半数最大效应浓度(EC50)分别为0.150、0.083 mg/L和0.383、0.170 mg/L[27]。异丙甲草胺作用72 h后，对四肩突四鞭藻(Bacillariophyceae)、布氏双尾藻(Dinophyceae)和微小原甲藻(Chlorophyceae)的EC50分别为21.300、0.423和 0.070 mg/L[28]。异丙甲草胺对膨胀浮萍(Lemnagibba)和槐叶萍(Salvinianatans)的EC50分别为23、50 μg/L[29-30]。

2.1.2 生理毒性效应

水生植物作为水体环境中的生产者，受到异丙甲草胺胁迫的来源与途径都比较广泛。研究异丙甲草胺对水生植物的影响，能较全面地认识异丙甲草胺对水体环境的污染现状。异丙甲草胺对水生植物的生理毒性效应主要包括对其生长、细胞分裂、光合色素含量以及抗氧化酶系的影响。杜氏藻(Dunaliellatertiolecta)和抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens)暴露于0.5～5.0 mg/L异丙甲草胺5 d，其生长抑制率达到9%，叶绿素含量的抑制率分别达到35%和25%，杜氏藻细胞密度抑制率更明显，达到70%，两种藻的细胞大小均增大，分别为1.20%和0.68%，细胞大小增大而细胞密度降低表明异丙甲草胺干扰藻类正常的细胞分裂[31]。附生硅藻暴露于5和30 μg/L的S-异丙甲草胺6 d后，叶绿素C和活细胞密度与对照组相比明显降低，结果表明S-异丙甲草胺对附生硅藻细胞增殖的干扰大于对光合作用的干扰[32]。凯氏拟小球藻(Parachlorellakessleri)在2～200 μg/L的S-异丙甲草胺中暴露4至72 h后，结果表明即使在低于EC5010到20倍浓度的S-异丙甲草胺中，S-异丙甲草胺对凯氏拟小球藻的影响仍然明显，其在藻类中产生活性氧，降低藻类的生长和光合色素的浓度，改变藻类的超微结构和细胞的抗氧化能力[33]。Rac-异丙甲草胺和S-异丙甲草胺处理蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)后藻体内的可溶性蛋白质和叶绿素含量降低，藻细胞出现质壁分离，叶绿体内积累大量的淀粉粒，处于分裂状态下的细胞数量增加，异丙甲草胺可能影响蛋白核小球藻的细胞分裂[34]。在异丙甲草胺中暴露96 h后，斜生栅藻细胞总可溶性蛋白含量与有毒物质浓度呈负相关，斜生栅藻细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性随有毒物质浓度的升高呈先激活后抑制的趋势，对斜生栅藻细胞膜通透性的影响总体上呈正相关[35]。Rac-及S-异丙甲草胺对水稻种子、根系均有毒性作用，能抑制水稻根系活力，破坏根尖细胞结构，抑制水稻根抗氧化酶系SOD、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活力，降低种子发芽率[36]。这些研究说明S-异丙甲草胺和Rac-异丙甲草胺均会破坏试验植物的细胞结构，抑制细胞生长和正常的代谢过程。

从上述可以得出，大多数关于异丙甲草胺对水生植物的毒性效应的研究报道呈现出药物剂量较高、作用时间短的特点。而异丙甲草胺在水体环境中，浓度一般较低，存在周期长，因此在往后的相关研究中可将异丙甲草胺对水生植物的慢性或亚慢性毒性作为一个研究重点。

2.2 对水生动物的毒性

2.2.1 急性毒性

水生动物作为食物链中比生产者高一级的消费者，研究异丙甲草胺对水生动物的急性毒性有助于初步评价其对人体产生损害的风险。斑马鱼胚胎在S-异丙甲草胺中暴露96 h，LC50为46.21 mg/L，发生畸变的EC50为29.40 mg/L[37]。太平洋牡蛎(Crassostreagigas)幼体在S-异丙甲草胺中暴露24 h，发生畸变的EC50为672 μg/L[38]。Rac-及S-异丙甲草胺对大型蚤(Daphniamagna)的LC50，24 h分别为69.4和51.2 mg/L[39]，根据毒性分级为低毒[40]。在24、48及72 h急性毒性实验中，异丙甲草胺对中华大蟾蜍(Bufogargarizans)幼体的LC50分别为29.81、28.81和25.83 mg/L[41]。

2.2.2 发育毒性

国内外关于异丙甲草胺对水生动物的毒性研究中，发育毒性是其中常见的研究指标，包括生长发育的影响、胚胎畸形、胚胎孵化率的影响等。太平洋牡蛎暴露在0.01 g/L的S-异丙甲草胺24 h后，其D型幼体畸形变异的百分率明显增大，而且S-异丙甲草胺的胚胎毒性和基因毒性比其降解产物异丙甲草胺乙烷磺酸和异丙甲草胺草酸更强[42]。0.1 μg/L异丙甲草胺能明显降低太平洋牡蛎精子的受精成功率和增加D型幼体畸形的发生率，从0.01 μg/L S-异丙甲草胺暴露的精子产生的后代，其发育发生变异的概率呈剂量依赖性增加[38]。异丙甲草胺及其降解产物异丙甲草胺草酸均会降低大理石纹螯虾(Procambarusvirginalis)的生长率[43]，异丙甲草胺草酸在42和420 μg/L的浓度下会导致其个体发育显著延迟[44]。S-异丙甲草胺的亚致死浓度会影响利比亚池蛙(Pelophylaxperezi)胚胎的正常发育，延迟孵化，缩短幼体的体长，并引起多种畸形，在较低浓度的测试中，幼体的长度也随着S-异丙甲草胺浓度的增加而减少[45]。70.0 mg/L的S-异丙甲草胺对斑马鱼胚胎的孵化抑制率近乎达到100%，并引起胚胎发育的畸形[37]。太平洋牡蛎幼体暴露于S -异丙甲草胺后，发育停滞的百分比从100 ng/L显著增加，而畸形的百分比仅在1 000 ng/L显著增加[46]。胚胎和幼年时期是动物生长发育的重要敏感阶段，该时期外源污染物的吸收和富集有可能导致胚胎、器官的发育不全，甚至引起死亡。因此，除草剂污染对水生动物发育生长的毒性效应有可能成为影响水产品质量安全的一个重要因素，如渔获量的降低，水产品肥满度下降等都有可能与之有关。

2.2.3 生理代谢毒性

生理代谢作为生物体维持正常生命活动的一系列化学反应的总称，在毒物试验中是一个研究热点。通过研究受试生物生理代谢活动的变化，分析毒物的毒性作用机理。在异丙甲草胺对水生动物的生理代谢毒性的研究中，受试动物的抗氧化酶系活力以及与生长代谢有关的组织、器官是常见的研究指标与对象。异丙甲草胺草酸会降低大理石纹螯虾超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽s-转移酶活性，降低谷胱甘肽水平和脂质过氧化作用，并引起大理石纹螯虾早期生活期间肝胰腺和鳃的病理变化[44]。暴露于S-异丙甲草胺与甲草胺草酸后，大理石纹螯虾的血淋巴、肝胰腺和鳃的生化指标明显不同于对照组，即使在28 d恢复期后，抗氧化生物标志物水平与对照组仍有明显不同[47]。在浓度110 μg/L的S-异丙甲草胺下，大理石纹螯虾的肝胰腺管系统包括焦解体管状上皮和上皮细胞数量显著减少,尤其是B细胞[44]。研究发现斑马鱼在9.66 mg/L的S-异丙甲草胺中暴露96 h后，S-异丙甲草胺可诱导其体内的谷胱甘肽转移酶(达256%)，抑制胆碱酯酶(达61%)和乳酸脱氢酶(达60%)，降低脂质过氧化水平(达63%)[37]。当暴露于与环境浓度(1 μg/L)相当的S-异丙甲草胺及其降解物的混合物中时，斑马鱼中与甲状腺代谢有关的基因会过度表达[48]。生活在异丙甲草胺浓度为119 ng/L水样中的藻虾(Palaemonetesintermedius)，检测出其乙酰胆碱酯酶活性与对照组相比有明显减低[49]。以上研究说明异丙甲草胺会干扰受试动物正常的生理代谢功能，对生物的酶系、细胞和组织等产生改变。现阶段关于异丙甲草胺对水生动物生理代谢的毒性多集中于酶系的影响，缺乏关于药物对生物体基因表达的影响，这一领域需要研究数据的补充。

2.2.4 其他毒性

异丙甲草胺的其他毒性主要是对水生动物行为状态的改变，进而影响其生存和繁殖状态。当太平洋牡蛎D型幼体暴露在环境浓度的S-异丙甲草胺中时，虽然最大移动速度和平均移动速度无明显变化，但移动路径中为圆形的概率会显著增大。目前的研究表明，直线型轨迹与正常幼体呈正相关，而贝壳异常幼体与圆形轨迹呈正相关。这种不正常的行为会影响幼体的生存和繁殖，从而影响新栖息地的形成和定殖[46]。高剂量亚致死浓度的异丙甲草胺可能会影响小龙虾(Procambarusclarkii)接收和回复群体信号的能力，进而影响并减弱小龙虾的竞争行为和攻击性[50]。目前关于异丙甲草胺对水生动物日常生命活动的影响研究较少，如鱼类、甲壳类动物的摄食行为、贝类的摄食和滤水行为等，这些数据能直观地反映异丙甲草胺对生物体生存状态的改变。

综上所述，有关异丙甲草胺对水生动物毒性效应的研究报道中，实验对象种类较多，涉及生理学、组织病理学、酶学和分子生物学等角度，但与水生植物的相关研究一样，低剂量药物暴露下亚慢性及慢性毒性的相关数据较少。另外，异丙甲草胺对映体的毒性差异也是一个有待突破的研究方向。

3 展望

异丙甲草胺作为一种重要的除草剂，于1978年实现工业化大规模生产，至今已有较长的使用时间。近几年随着环保要求的提高，欧洲部分国家和地区已逐步禁止使用异丙甲草胺，转为使用其活性体精异丙甲草胺[51]，精异丙甲草胺除草活性更高，因而减少了施用量以及异构体的种类。但鉴于异丙甲草胺的难降解性以及在大部分国家中仍然使用的现状，同时异丙甲草胺降解产物异丙甲草胺乙烷磺酸(MESA)和异丙甲草胺草酸(MOA)被确定为地下水中存在的农药衍生化合物[52]，异丙甲草胺及其相关产物在未来农业生产中仍会产生相当大的影响，并成为新型污染物，关于异丙甲草胺对水生生物的毒性效应以及对水产品质量安全的影响具有更加深入的研究意义。

现今大多数关于除草剂污染的毒理学研究，通常集中于高剂量暴露的影响上，但现实中水体农药浓度一般处于低浓度，为了解除草剂污染对自然环境和生物的影响，未来的研究应将重点集中于除草剂在慢性、低剂量的暴露水平下，对环境和生物的影响上。

另外，异丙甲草胺的毒性效应并不是单独发生的，可能具有与其他因素联合作用的影响，如温度、气候[53]、农药混合物[49,54-55]、重金属[56]、天然溶解的有机物[57]以及异丙甲草胺的降解产物MESA、MOA。MESA、MOA更稳定，流动性更强[43]，可以在土壤中维持3年或更长时间，其出现频率通常是母体的3～45倍。有研究表明这两种降解产物对水生物种形成威胁，毒性机制与异丙甲草胺不同[42,47]，在基因表达水平上，降解物的影响比母体更强[48]，但降解物的毒性机理仍需深入研究。藻类是水生生物的基本组成部分，受农药污染比较严重，有研究表明被农药污染后受损的藻类细胞仍能分裂[33]，这可能是一个潜在的环境毒性因素，会进一步影响食物链中的高等生物。因此研究异丙甲草胺在水生生物中的富集作用以及在食物链中的传递也是值得关注的研究方向，这可更全面的反映异丙甲草胺的污染状况，为完善相关的环保监督机制提供技术支撑。

今后对异丙甲草胺的研究可以从以下三方面深入：一是验证异丙甲草胺对生化和基因组水平的影响；二是分析降解产物对生物体产生毒性影响的作用机理；三是综合考虑其他因素，包括物理、化学的影响因素和环境、气候因素，综合评价其毒性效应。综合考虑异丙甲草胺单独以及与各种因素的联合效应，才能更准确地评估其生态风险性，提高其在农业生产使用中的合理性，降低其对环境、生物和人类的潜在风险。