果蔬中氟吡菌酰胺残留检测方法研究进展

杨艺玥 杨 明 郑鹭飞

（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所， 农业农村部农产品质量安全重点实验室， 北京 100081）

氟吡菌酰胺是琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂，通过作用于真菌线粒体呼吸链内的琥珀酸脱氢酶（复合物 II）而阻止真菌生长[1]。 2012 年， 氟吡菌酰胺在我国已获得登记， 目前登记作物包括15 种水果、8 种蔬菜、 2 种药用作物和 1 种经济作物[2]， 具有很大的应用潜力。 氟吡菌酰胺具有高效、 广谱、 持效性强和选择性强等特点。 同时， 氟吡菌酰胺还具有优异的内吸传导性， 通过叶或根吸收后在植物体内传导达到抑菌效果， 并产生一系列代谢产物， 鉴于这种特殊的作用机制， 氟吡菌酰胺易残留于果蔬的可食用部分[3]。 因此， 开展果蔬中氟吡菌酰胺残留的检测方法研究， 对科学监测和评估氟吡菌酰胺的残留风险具有重要的意义。 目前， 氟吡菌酰胺的检测方法主要有气相色谱法[4～7]、 气相色谱－质谱法[8～13]和液相色谱－质谱法[3，14～22]等。 但是 GB 2763－2021 《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[23]中缺少氟吡菌酰胺残留检测的标准方法。 本文综述了果蔬中氟吡菌酰胺残留检测方法的研究现状， 系统比较了各种方法的优缺点， 旨在为今后果蔬中氟吡菌酰胺的检测标准方法开发提供参考。

一、 氟吡菌酰胺毒性和理化性质

氟吡菌酰胺是一种稳定且非挥发性的农药[24]，其外观为白色粉末， 无明显气味， 熔点117.5℃，沸点318～321℃。 氟吡菌酰胺水溶性较低， 20℃时， 其在水中的溶解度为15～16 mg/L， 蒸气压为1.2×10－6Pa， 其在甲醇、 丙酮、 二氯甲烷、 乙酸乙酯和二甲基亚砜中的溶解度大于250 g/L， 土壤有机质－水分配系数 （KOC） 值为 266～460[25]， 土壤对其的吸附能力强[3]， 正辛醇/ 水分配系数 （Kow）值为 3.3 （pH 6.5）。

根据联合国粮食及农业组织和世界卫生组织农药残留专家联席会议（JMPR） 氟吡菌酰胺毒理学评估报告， 氟吡菌酰胺具有急性毒性， 大鼠经口半数致死量 （LD50）＞2 000 mg/kg bw， 大鼠经皮 LD50＞2 000 mg/kg bw， 大鼠鼻吸入半数致死浓度 （LC50）＞5.11 mg/L air （暴露 4 h）， 对皮肤和眼睛无刺激性， 能造成小鼠甲状腺瘤和大鼠肝肿瘤； 每日允许摄入量 （ADI） 为 0～0.1 mg/kg bw， 急性参考剂量（ARfD） 为 0.5 mg/kg bw[21～22]。

二、 氟吡菌酰胺的登记情况与残留现状

根据中国农业信息网， 截至 2022 年5 月 23日， 氟吡菌酰胺已登记用于26 种作物， 包括水果15 种 （草莓、 柑橘、 桃、 梨、 荔枝、 芒果、 苹果、葡萄、 甜瓜、 西瓜、 香蕉、 杨梅、 樱桃、 猕猴桃、枇杷）， 蔬菜 8 种 （番茄、 黄瓜、 苦瓜、 辣椒、 马铃薯、 茄子、 洋葱、 豇豆）， 药用作物 2 种 （人参、三七）， 经济作物1 种 （烟草）。 氟吡菌酰胺可以防治黄瓜、 番茄、 辣椒等蔬菜易感染的灰霉病、 白粉病、 霜霉病[6，13，26～29]等， 还可防治多种线虫[30～31]， 用作农产品保鲜剂、 种子处理剂[32]。 在氟吡菌酰胺可防治的病虫害中， 如胡萝卜、 山药等小宗作物容易遭受白粉病、 根结线虫病的侵害， 但氟吡菌酰胺尚未在这些作物上进行登记使用。

根据文献报道， 目前氟吡菌酰胺在不同作物中进行的农药残留田间试验， 其最终残留量均小于最大残留限量 （见表1）。 联合国粮食及农业组织于2010年开展食品中农药残留评估[24]时使用同位素示踪技术在植物中共鉴定出氟吡菌酰胺的17 种代谢物，并指明在田间良好农业规范试验中， 氟吡菌酰胺残留主要以母体 （见图1 A） 及其代谢物2－（三氟甲基）苯甲酰胺（见图1 B）的形式分布于作物与土壤中。 欧洲食品安全局[36]根据代谢研究结果， 将氟吡菌酰胺风险评估定义确定为 “氟吡菌酰胺与2－（三氟甲基） 苯甲酰胺之和， 以氟吡菌酰胺表示”。 目前， 我国GB 2763－2021 标准对作物中氟吡菌酰胺残留物的定义规定为 “氟吡菌酰胺母体”， 但为满足风险评估的要求并与国际标准接轨， 果蔬中氟吡菌酰胺残留检测对象应包括其代谢物2－（三氟甲基） 苯甲酰胺。 因此， 要加快氟吡菌酰胺及其代谢物标准检测方法的制定， 从而推动氟吡菌酰胺在多种果蔬上的登记和其最高残留限量的制定， 以满足实际生产和安全用药需求。

表1 氟吡菌酰胺田间试验最终残留量情况

图1 氟吡菌酰胺 （A） 及其代谢物2- （三氟甲基）苯甲酰胺 （B） 结构式

三、 氟吡菌酰胺残留检测方法研究进展

（一） 气相色谱法气相色谱法灵敏度高、 应用范围广、 检测限低， 能够用于检测热稳定性强、易气化、 不易分解的物质。 氟吡菌酰胺易气化， 在高温下不易分解[37]， 因而无须衍生化即可通过气相色谱进行分析。

近年来利用气相色谱分析不同果蔬中氟吡菌酰胺残留的检测方法汇总见表2， 其中胡琴等[38]使用气相色谱－氢火焰离子化检测器 （GC－FID）， 以邻苯二甲酸二环己酯为内标物， 首次对氟吡菌酰胺进行定性定量分析， 方法平均回收率为99.75%，但该方法未在实际样品上应用。 于福利等[4]、 邓曼等[5]和GUAN 等[7]应用气相色谱－电子捕获检测器（GC－ECD）， 对蔬菜和环境样品 （黄瓜、 番茄和土壤） 以及 6 种水果样品 （西瓜、 葡萄、 草莓、 柑橘、 苹果和梨） 中的氟吡菌酰胺残留进行了测定。MAGDALENA 等[6]使用配备氮磷检测器 （NPD）和微电子捕获检测器 （μECD） 的气相色谱仪， 结合丙酮提取、 二氯甲烷萃取的前处理方法， 检测苹果果实和叶片中的氟吡菌酰胺残留， 方法平均添加回收率在70%～120%的范围内。

表2 气相色谱检测果蔬中氟吡菌酰胺残留的方法汇总

采用气相色谱法能够较好地分离氟吡菌酰胺，且该方法操作简单， 成本较低， 定量能力强， 但其定性及结构分析能力弱， 需与其他检测器结合使用。

（二） 色谱－质谱联用法色谱－质谱联用法[39]结合了色谱的分离能力与质谱的结构分析能力， 能够对复杂基质中的氟吡菌酰胺及其代谢物进行准确定性、 定量及结构分析， 具有高效分离、 高灵敏度的特点， 目前广泛应用于植物源食品中氟吡菌酰胺残留分析。

1. 气相色谱－质谱联用（GC－MS）法。 与气相色谱法相比较， 气相色谱－质谱联用法能够采用保留时间以及特征离子进行双重定性， 在定量步骤中没有干扰， 具有分辨率高、 灵敏度高且重现性好的特点， 可以弥补气相色谱法分析氟吡菌酰胺过程中存在的检测灵敏度相对较低等不足[8]， 被逐渐应用于不同果蔬中氟吡菌酰胺残留分析研究。

DONG 和 HU[9]使用 GC－MS 结合 QuEChERS前处理方法， 首次同时分析了西瓜和土壤中氟吡菌酰胺的残留情况， 检出限分别为 0.002 mg/kg 和0.003 mg/kg， 定量限为 0.01 mg/kg。 李文卓等[8]则首次使用气相色谱－串联质谱 （GC－MS/MS） 结合QuEChERS 前处理方法， 建立了一种同时检测7 种蔬菜样品 （洋葱、 青花菜、 莴苣、 番茄、 黄瓜、 扁豆和马铃薯） 中氟吡菌酰胺残留的分析方法。 此外， NAGAPOOJA 等[10]、 PENG 等[11]、 孙雪梅 等[40]、 SAPNA 等[12]和 ZHOU 等[13]都 使 用 GCMS/MS 结合QuEChERS 前处理方法分别建立了石榴、 番茄、 黄瓜、 辣椒、 白菜、 豇豆、 西葫芦、 豆荚、 香蕉和土壤中氟吡菌酰胺残留的分析方法。PENG 等[11]通过 GC－MS/MS 全扫描模式研究了大棚作物番茄、 黄瓜、 辣椒中氟吡菌酰胺的残留情况， 同时根据特征碎片和数据库检索鉴定出3 种氟吡菌酰胺代谢物 （见图2）， 推测氟吡菌酰胺在这些果蔬内首先裂解为TMB［2－（三氟甲基）苯甲酰胺］和 TPE ［2－（3－chloro－5－（trifluoromethyl）pyridin－2－yl）ethanol］， TPE 随后经系列反应形成TPA ［3－chloro－5－（trifluoromethyl）picolinic acid］和 TPAA ［3－chloro－5－（trifluoromethyl）pyridine－2－acetic acid］， 其中 TMB 是初级代谢产物， TPA和TPAA 是次级代谢产物。

图2 氟吡菌酰胺在果蔬生态系统中的可能代谢途径

气相色谱－质谱联用仪的各种型号仪器之间数据库通用， 且气相色谱－质谱联用仪分离效率高，灵敏度高， 适用于定性定量分析， 但对用于分析的样品状态要求高， 前处理步骤复杂。

2. 液相色谱－质谱联用 （LC－MS） 法。 应用液相色谱－质谱联用法检测果蔬中氟吡菌酰胺残留的研究要晚于气相色谱－质谱联用法， 采用液相色谱－质谱联用法检测果蔬中氟吡菌酰胺残留的色谱和质谱条件见表3。

表3 采用液相色谱－质谱联用法检测果蔬中氟吡菌酰胺残留的仪器条件参数

2016 年， PATEL 等[18]建立了一种 UPLC－MS/MS检测洋葱和土壤中氟吡菌酰胺残留的分析方法， 该方法检出限为0.017 mg/kg， 定量限为0.05 mg/kg。SAHA 等[19]利用 HPLC－MS/MS 建立了辣椒中氟吡菌酰胺残留的分析方法， 结果表明， 在0.01～0.25 mg/kg 添加水平下氟吡菌酰胺的平均回收率为83.5%～91.4%， 相对标准偏差低于6.5%， 检出限为0.003 mg/kg， 定量限为 0.01 mg/kg。 SUCHI 等[3]依托UPLC－MS/MS 对黄瓜中的氟吡菌酰胺进行残留持久性评估， 方法回收率和精确度良好。 MAHDAVI等[16]使用UPLC－MS/MS 分析了开心果、 椰枣和土壤中氟吡菌酰胺的残留量， 方法的回收率为80.6%～93.5%， 相对标准偏差低于10.8%。 除使用 UPLC－MS/MS 和 HPLC－MS/MS 外， 学者们利用LC－MS/MS 也开发了可靠的分析方法， 例如MATADHA 等[20]使用 LC－MS/MS 探究了氟吡菌酰胺在番茄和甜椒中的吸收和分布情况， 开发的方法的检出限和定量限分别为0.001 5 mg/kg 和0.005 mg/kg。 近两年， 我国科研人员范金平等[17]、 陈丽

霞等[14]、 贾春虹等[15]和FENG 等[21]依托 UPLC－MS/MS 或 LC－MS/MS 先后建立了芒果、 黄瓜、 番茄、茄子、 草莓和甜瓜中氟吡菌酰胺残留的分析方法。

此外， VARGAS-PÉREZ 等[37]采用超高效液相色谱（UPLC）与高分辨质谱（HRMS）联用技术， 对番茄和黄瓜中的氟吡菌酰胺及其代谢物2－（三氟甲基） 苯甲酰胺进行了检测， 具体质谱监测参数见表4。LI 等[41]使用UPLC－HRMS 分析了氟吡菌酰胺在苹果中的残留情况， 并且推测氟吡菌酰胺在苹果酶促水解过程中可能发生裂解、 脱氯、 羟基取代和氧化转化等系列反应， 进而生成 P1、 P2、 P3 3 种代谢产物（见图 3）。 LAMFALUSY 和 SOROS[42]使用 LCMS/MS 分析了樱桃中氟吡菌酰胺的残留情况并鉴定出两种氟吡菌酰胺代谢物， 即单羟基－氟吡菌酰胺（M08 或 M18）和去氯－氟吡菌酰胺（见图 4）。

表4 氟吡菌酰胺及其代谢物MRM 多反应监测质谱参数

图3 氟吡菌酰胺在多聚半乳糖醛酸酶解中的可能转化途径

图4 氟吡菌酰胺在樱桃中的残留代谢物

液相色谱－质谱联用法灵敏度高， 可准确定量及定性分析氟吡菌酰胺及其多种代谢物， 是欧洲食品安全局和联合国粮食及农业组织测定氟吡菌酰胺及其代谢物的推荐分析方法。

四、 结论与展望

综上所述， 目前氟吡菌酰胺残留检测技术中，最为成熟与可靠的是气相色谱技术与色谱－质谱联用技术， 这两种技术在氟吡菌酰胺定量检测和氟吡菌酰胺代谢物结构分析方面具有不可取代的地位，已经成功用于多种果蔬中氟吡菌酰胺及其代谢物的残留分析。

但是仪器方法存在耗时长、 成本高、 需要专业人员进行操作的问题。 近年来， 果蔬中农药残留快速检测方法发展迅速， 西班牙研究团队的CEBALLOS-ALCANTARILLA 等[43]首次制备了氟吡菌酰胺的特异性、 高亲和力单克隆抗体， 从而实现了运用酶联免疫吸附 （ELISA） 法检测氟吡菌酰胺残留，该方法成功应用于李子、 葡萄、 葡萄汁、 葡萄酒4种实际样品中氟吡菌酰胺的残留分析。 但目前我国关于快速检测技术应用于果蔬中氟吡菌酰胺残留分析的研究鲜有报道， 因此开发建立准确、 灵敏、 简单和快捷的果蔬中氟吡菌酰胺检测标准方法是亟待解决的问题。 氟吡菌酰胺施用于不同农作物后， 其代谢产物和代谢途径存在差异， 但内在的机制尚不明确。 因此， 开发果蔬中的氟吡菌酰胺代谢产物的鉴定与检测方法， 也是今后的重点工作之一。