苯噻酰草胺胁迫对中华绒螯蟹幼蟹的毒性效应

黄晓丽，吴松，黄丽，王鹏，陈中祥，覃东立,3*

(1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150076；2.农业农村部黑龙江流域渔业生态环境监测中心，黑龙江 哈尔滨 150076；3.农业农村部水产品质量安全控制重点实验室，北京 100141)

稻渔综合种养是实现农业生产、资源开发和环境保护相互协调发展的生态循环农业模式之一[1]。近年来，稻渔综合种养模式得到大力扶持和推广，2019年养殖面积达231.75 万hm2，产量超过290万t[1]。随着稻渔综合种养产业规模的提高，稻田病虫草害防治过程中施药与养殖生物生长风险及质量安全之间的矛盾日益突出[2-3]。农药不仅对水生动物具有致死效应，还影响其个体发育、生殖及行为[4-5]，导致生物体组织病理变化[6-7]，引起生物体脂质过氧化损伤和相关抗氧化酶活力变化等[8-9]。因此，系统评估稻田施用农药对养殖生物的毒性效应对于科学养殖及指导生产具有重要意义。

中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)是中国重要经济甲壳类养殖品种之一。稻蟹种养在东北地区发展较快，2019年东北三省稻田养殖面积超过1533.33 km2，辽宁省盘锦市是中国北方最大的中华绒螯蟹养殖基地[10]。中华绒螯蟹的生长、代谢及繁殖受温度、营养盐浓度、重金属、有机污染物等环境因素影响较大[11-14]。水稻种植过程中广泛使用的除草剂已被证实对中华绒螯蟹具有急性毒性，有学者在残留效应、组织病理等方面开展了相关研究[15-18]。苯噻酰草胺是一种在东北地区广泛使用的高效、高选择性的触杀性除草剂，对水生生物的直接毒性较低，但可转换为毒性较强的二烷基醌亚胺[19]。该农药能够诱发斑马鱼(Brachydanioreriovar)红细胞核异变，具有遗传毒性[20]；与其他化合物联合作用时对水蚤毒性较大[21]，但其对中华绒螯蟹幼蟹的急性毒性尚未见报道。

本研究结合除草剂施用的实际情况，以中华绒螯蟹幼蟹作为研究对象，采用半静态体外暴露法，考察了中华绒螯蟹幼蟹短期暴露于苯噻酰草胺14 d过程中蟹体内鳃和肝胰腺组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和丙二醛(MDA)的含量变化，综合评价了苯噻酰草胺对中华绒螯蟹幼蟹的脂质过氧化损伤和相关抗氧化酶系统的影响，旨在为稻渔综合种养模式中农药施用及科学养殖提供参考数据及科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

因稻田中苯噻酰草胺的施用时间在每年的5月，因此本研究选择的受试生物为农药施用期的中华绒螯蟹幼蟹。实验用中华绒螯蟹幼蟹购自辽宁省盘锦市养殖基地，体重为(20.56±2.40)g。正式实验前将购买的中华绒螯蟹幼蟹于充分曝气的自来水中暂养2周，平均水温(25±2)℃，pH为6.55～7.53，暂养期间正常投喂。暂养后随机选取规格一致、健康有活力、体色正常、无外伤、附肢健全的幼蟹进行毒性效应实验。

1.2 仪器与试剂

U-4100紫外可见分光光度计(日本日立)、DZKW-4恒温水浴箱(北京永光明)、Allegra X-30R低温冷冻离心机(美国Beckman Coulter)、VORTEX 3漩涡混匀器(德国IKA)、T25组织匀浆机(德国IKA)。供试药品为纯度98%的苯噻酰草胺粉末状原药，购于江西众和生物科技有限公司；丙酮(分析纯)，购于国药集团化学试剂有限公司。实验所需的SOD、CAT、MDA和蛋白质测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 急性毒性实验

实验在玻璃缸(长35 cm×宽15 cm×高25 cm)中进行。实验用水为曝气自来水，水温在24～28 ℃之间、pH在6.57～7.68之间，24 h连续曝气，水体溶解氧(DO)保持在6.0 mg/L以上，实验期间不投喂。实验采用半静态体外暴露法，首先通过预实验确定幼蟹的24 h全死亡浓度(10 mg/L)和96 h无死亡浓度(0.01 mg/L)。在0.01～10.00 mg/L的浓度之间，按照等比级数设6个浓度梯度(0.01、0.04、0.16、0.64、2.50 和10.00 mg/L)，并设置空白对照组(曝气自来水)以及助溶剂(丙酮)对照组，每个浓度组设4 个平行。每个玻璃缸放入6只中华绒螯蟹幼蟹，以96 h为一个实验周期，每24 h更换一次实验溶液。实验开始后，定时观察幼蟹的存活状况，测定水体pH、DO和温度，分别记录幼蟹在24、48、72及96 h时的行为变化和死亡情况，及时捞出死亡的实验动物。

1.4 相关氧化应激指标的测定

急性毒性实验结束后，继续在相同的条件下进行氧化应激指标考察实验。分别于实验的0、4、10和14 d，从各浓度组取出3～4只存活的幼蟹。实验过程中，0.63、2.51、10.00 mg/L苯噻酰草胺浓度组的受试幼蟹全部死亡，因此不进行分析。幼蟹置于冰上，迅速解剖取出鳃和肝胰腺组织，经预冷的PBS缓冲溶液淋洗，用滤纸吸收组织表面水分。称取0.2 g采集的组织样品，用预冷的0.86%生理盐水以1∶9(W∶V)的配比冰浴匀浆，5 000 r/min冷冻离心10 min，取上清液测定蛋白质、SOD、CAT和MDA，具体操作步骤按照试剂盒中的说明书进行。组织中可溶性蛋白质含量，抗氧化指标SOD、CAT 活性及MDA含量的测定均采用南京建成生物工程研究所试剂盒的方法测定。

1.5 半致死浓度(LC50)与安全浓度(SC)计算

采用寇氏法计算苯噻酰草胺对中华绒螯蟹幼蟹的半致死浓度(LC50)[21]。计算公式如下：

LgLC50=Xm-i(∑P-0.5)

式(1)

安全浓度(Safe concentration，SC)计算公式如下[22]：

SC=LC50(96h)×0.1

式(2)

其中，LgLC50为半致死浓度10为底的对数值，Xm为最大处理浓度的对数值，i为相邻组浓度对数差，∑p为各浓度组死亡率总和。

1.6 数据处理

实验数据以平均值±标准误差(X ± SE)表示，利用Prism 7.0 软件绘制图片，SPSS 19.0 软件进行统计学分析。用单因素方差分析法(One-way ANOVA)分析急性胁迫引起的各不同浓度梯度间差异，以P<0.05为差异显著水平。

2 结果与分析

2.1 苯噻酰草胺对中华绒螯蟹幼蟹的急性毒性

不同浓度苯噻酰草胺胁迫下的中华绒螯蟹幼蟹随着暴露时间的延长出现了不同程度的中毒症状。实验期间，空白对照组和溶剂对照组均无中毒和个体死亡现象，且活力正常。在0.01 mg/L浓度胁迫下，整个过程中大多数个体都较活泼，个别个体出现了轻微中毒症状；在0.04 mg/L浓度组暴露初期，与对照组相比幼蟹无异常行为，暴露72 h后出现游动变缓、反应迟钝等中毒症状；在0.16和0.63 mg/L苯噻酰草胺浓度组的幼蟹暴露48 h后逐渐出现反应迟钝、抱团、附肢脱落和个体死亡的中毒现象。高浓度苯噻酰草胺胁迫对幼蟹具有明显的毒性作用，在10.00 mg/L浓度胁迫下，幼蟹在短时间内出现躁动不安、游动迟缓、反应迟钝等现象，然后逐渐出现抱团、部分附肢脱落、腹部上翻及躯体僵直的中毒症状，暴露72 h后90%以上的个体死亡。

幼蟹的死亡数与苯噻酰草胺溶液间具有明显的时间-效应和剂量-效应关系。随着苯噻酰草胺浓度的升高和胁迫时间的延长，中华绒螯蟹的存活率明显下降，死亡率增加。胁迫24 h 时，≤2.51 mg/L浓度组中幼蟹死亡率低于20%，而10.00 mg/L浓度组中幼蟹死亡率达41 %，与其他组别的死亡率存在显著性差异(P<0.05)。胁迫48 h时，≤2.51 mg/L浓度组幼蟹死亡率低于25%，而10.00 mg/L浓度组幼蟹死亡率达62%，与其他组别的死亡率存在显著性差异(P<0.05)；胁迫96 h 后，≤0.63 mg/L浓度组幼蟹死亡率≤50%，2.51 mg/L浓度组死亡率达95%，10.00 mg/L浓度组中，幼蟹全部死亡(表1)。在胁迫72 h和96 h条件下，2.51 和10.00 mg/L浓度组与其他组别的死亡率存在显著性差异(P<0.05)。数据分析获得苯噻酰草胺对中华绒螯蟹幼蟹胁迫24、48、72、96 h的LC50分别为5.31、2.11、0.47和0.18 mg/L(表1)，安全浓度为0.018 mg/L。

表1 苯噻酰草胺对中华绒螯蟹幼蟹的急性毒性Tab.1 Acute toxicity of mefenacet on the juveniles Chinese mitten crab

2.2 苯噻酰草胺对中华绒螯蟹幼蟹鳃组织中SOD、CAT活力及MDA含量的影响

鳃组织中的SOD活力随着胁迫时间延长呈先升高后降低的趋势(图1)，各浓度组均在第4 d达到峰值，且随暴露浓度升高而增加。胁迫第4 d的SOD活力与对照组相比均有升高，0.04和0.16 mg/L浓度组SOD活力显著高于其他浓度组(P<0.05)。在胁迫第10 d，0.01和0.04 mg/L浓度组SOD活力与对照组相比无显著性差异，0.16 mg/L浓度组显著增加。在胁迫第14 d，各浓度组SOD活力略高于对照组但无显著性差异。鳃中CAT活力与SOD活力呈现显著的正相关(P<0.05)，随暴露时间的延长呈先上升后下降趋势。各浓度组的CAT活力均在第4 d达到峰值，并随暴露浓度升高而增加。在胁迫第4 d，各浓度组间CAT活力无显著差异。在胁迫第10 d，0.01和0.04 mg/L浓度组与对照组相比无显著性差异，0.16 mg/L 浓度组中CAT活力显著低于对照组和其他浓度组(P<0.05)。胁迫第14 d，0.04和0.16 mg/L浓度组显著低于对照组和其他浓度组(P<0.05)。不同浓度苯噻酰草胺对幼蟹鳃组织抗氧化效应的影响存在一定的差异。0.01、0.04 mg/L浓度组，鳃中的MDA含量随暴露时间的延长整体呈先上升后下降的趋势，但峰值出现的时间不同。各浓度组MDA含量波动较大，在胁迫14天后，各浓度组间无显著性差异。

图1 中华绒螯蟹幼蟹鳃中SOD、CAT活力及MDA含量的影响同一处理时间下，不同字母表示组间差异显著(P<0.05)，下同Fig.1 The mefenacet effects on SOD activity,CAT activity and MDA concentration in gill of juveniles Chinese mitten crabUnder the same processing time,different letters mean with significant difference (P<0.05),the same below.

2.3 苯噻酰草胺对中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺组织中SOD、CAT活力及MDA含量的影响

幼蟹肝胰腺组织中SOD、CAT活力及MDA含量随苯噻酰草胺浓度变化的趋势与鳃组织中的有所不同。肝胰腺组织中SOD活力随胁迫时间延长呈上升-下降的波动变化趋势，各浓度组均在胁迫第10 d达最高值，这与鳃组织中的结果明显不同。胁迫10 d后，不同苯噻酰草胺浓度下SOD活力均高于2个对照组，且具有显著性差异(P<0.05)。肝胰腺中CAT活力对苯噻酰草胺浓度变化反应敏感(图2)，随着胁迫时间延长呈逐渐上升趋势。不同苯噻酰草胺浓度处理组肝胰腺中的CAT活力与对照组相比均有升高，0.04和0.16 mg/L胁迫浓度下差异显著(P<0.05)。随着苯噻酰草胺浓度从0 升至0.16 mg/L，CAT活力表现出显著的剂量-效应关系，在苯噻酰草胺浓度为0.16 mg/L时达最高值。肝胰腺组织中的MDA含量随着胁迫时间延长基本上呈升高趋势，且随着暴露浓度升高而增加。在0.04和0.16 mg/L胁迫浓度下，胁迫14 d内肝胰腺组织中MDA含量与对照组相比均具有显著性差异(P<0.05)(图2)。

图2 中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺中SOD、CAT活力及MDA含量的影响Fig.2 The mefenacet effects on SOD activity,CAT activity and MDA concentration in hepatopancreas of juveniles Chinese mitten crab

3 讨论

3.1 苯噻酰草胺对中华绒螯蟹的急性毒性

苯噻酰草胺对水生生物具有较为显著的毒性[23-24]，对不同水生动物产生的急性致死效应不同。苯噻酰草胺对日本虎斑猛水蚤(Tigriopusjaponicus)、苏拉威西秀体溞(Diaphanosomacelebensis)、褶皱臂尾轮虫(Brachionusplicatilis)的24 h LC50分别为30.39、23.01和50.00 mg/L[23]，对热带蝌蚪的24、48、72和96 h LC50值分别为3.06、2.95、2.79和2.70 mg/L[24]，对鲤(Cyprinuscarpio)的96 h LC50为6.0 mg/L[25]。本研究中苯噻酰草胺对幼蟹的24、48、72和96 h LC50值分别为5.31、2.11、0.47和0.18 mg/L，可见甲壳类等无脊椎动物比鱼类对苯噻酰草胺更敏感。参照《化学农药环境安全评价试验准则》中农药对鱼类的毒性分级标准[21]，苯噻酰草胺对中华绒螯蟹幼蟹的毒性等级为高毒(0.1 mg/L

苯噻酰草胺对中华绒螯蟹幼蟹毒性的浓度-效应明显，随着暴露时间的延长LC50越小，且在急性毒性实验后仍继续死亡，这可能是由于农药在幼蟹体内富集或转化为毒性更强的代谢产物导致。因此，低浓度苯噻酰草胺不会造成中华绒螯蟹幼蟹大规模迅速死亡，但长期低剂量暴露可造成不可逆损伤，甚至死亡。

3.2 苯噻酰草胺胁迫对中华绒螯蟹幼蟹相关氧化应激指标的影响

本研究中，苯噻酰草胺胁迫下，中华绒螯蟹幼蟹鳃组织中的SOD活力、CAT活力随着暴露时间和浓度的增加，均表现为先上升后下降的趋势，且达到峰值的时间具有同步性；肝胰腺组织中的SOD、CAT活力变化趋势与鳃相似，也表现为随着暴露时间延长先增加后降低。然而，中华绒螯蟹幼蟹鳃中SOD、CAT活力诱导作用明显早于肝胰腺，这可能是因为鳃组织能够直接吸收水环境中的污染物，对苯噻酰草胺暴露更敏感，这一研究结果与苯并[a]芘对三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)的毒性研究结果相似[32]。本研究结果表明，低浓度苯噻酰草胺的胁迫能够在短期内促进中华绒螯蟹幼蟹的防御能力，这是由于当外源污染物进入到受试生物体内，导致自由基大量形成，促使体内SOD、CAT活力增加进而加快自由基的清除[33]；而高浓度苯噻酰草胺或长时间胁迫下，自由基形成过量且超出生物体可清除的范围时，SOD、CAT活力受到抑制[34]，这可能是SOD和CAT活力先升后降的原因。

MDA是脂质过氧化的代谢产物之一，也是反映细胞氧化损伤的指标之一。本研究结果表明，苯噻酰草胺胁迫下，MDA在肝脏中的诱导水平显著高于鳃组织，说明幼蟹肝胰腺组织受到的脂质过氧化作用远高于鳃组织。蒋闰兰等[35]研究也发现，不同菲浓度处理中华绒螯蟹机体受氧化损伤程度存在组织差异，其中肝胰腺受损伤的程度较鳃组织严重。分析机体受氧化损伤程度出现组织差异的原因与组织在机体内的功能不同有关，鳃组织主要功能是进行气体交换，而肝胰腺是有毒物质的主要代谢场所。作为有机污染物，苯噻酰草胺具有亲脂性，肝胰腺中脂肪含量较高有利于苯噻酰草胺蓄积。在不同苯噻酰草胺浓度胁迫下，MDA含量存在显著性差异，表明生物体受氧化损伤程度与苯噻酰草胺浓度密切相关，在菲对中华绒螯蟹毒性效应的研究也证实了这一结论[35]。肝胰腺中MDA含量变化规律与鳃中不同，其与苯噻酰草胺浓度间关系更为密切，且与鳃相比，肝胰腺中MDA含量对苯噻酰草胺浓度变化有更高的敏感性。本实验中，肝胰腺中MDA含量与较高浓度苯噻酰草胺间有显著的剂量-效应关系。

4 结论

苯噻酰草胺对中华绒螯蟹幼蟹毒性等级为高毒，24、48、72、96 h LC50分别为5.31、2.11、0.47和0.18 mg/L，安全浓度为0.018 mg/L。低浓度苯噻酰草胺不会造成受试生物大规模迅速死亡，但长期低剂量暴露可造成不可逆损伤。在较高浓度苯噻酰草胺胁迫下，中华绒螯蟹幼蟹引起肝胰腺和鳃组织的脂质过氧化损伤；在0.018 mg/L浓度苯噻酰草胺胁下，能够通过诱导机体抗氧化酶CAT和SOD活力升高来降低苯噻酰草胺胁迫危害。