乳酸菌发酵对乳清蛋白酶解物风味和免疫调节活性的影响

高婧昕，李天歌，郭凯睿，毛学英

（中国农业大学食品科学与营养工程学院 教育部北京市共建功能乳品重点实验室食品精准营养与质量控制教育部重点实验室 北京 100083）

蛋白质是机体必需的营养物质之一，主要以氨基酸和肽的形式被机体吸收利用，相比于游离氨基酸，肽的吸收转运快、耗能低且利用率高[1]。生物活性肽是源自蛋白质的功能活性片段，通常具有2～20 个氨基酸[2]。乳蛋白是制备生物活性肽的优质蛋白，研究发现乳蛋白肽具有降血压、抗氧化、抑菌和免疫调节等多种生物学活性[3-6]。其中，免疫调节肽能激活机体细胞免疫和体液免疫反应，提高机体抵抗病原物质感染的能力[7]。O'Sullivan 等[6]发现酪蛋白酶解物能显著降低Jurkat T细胞和RAW264.7 巨噬细胞中炎症因子白介素-6的产生并抑制炎症相关信号通路的表达。

目前制备生物活性肽的主要方法是酶解，然而酶解法制备的生物活性肽往往有不同程度的苦味，制约了其工业化应用。多肽的苦味与肽链中疏水性氨基酸残基的位置、含量和类型密切相关，大多数苦味肽的肽链末端带有疏水性氨基酸，蛋白酶解物中暴露的疏水性氨基酸残基越多，苦味越重[8]。改善乳蛋白酶解物风味是亟待解决的技术关键。Chesion 等[9]将乳清蛋白酶解，通过大孔吸附树脂分离其中的苦味成分，造成蛋白酶解物营养价值降低。利用外肽酶酶切肽链末端的疏水性氨基酸也能有效去除苦味[10]，然而目前尚无可广泛用于食品工业的外肽酶。微囊化技术通过包裹多肽掩盖其苦味。Sarabandi 等[11]研究发现采用微胶囊技术虽可降低酪蛋白酶解物的苦味，但在一定程度抑制了其生物学活性。此外，美拉德反应对蛋白酶解物的风味也有改善效果[12]，然而美拉德反应改变酶解物的色泽，其产生的晚期糖基化终末产物是许多疾病的诱发因素[13]，对食品安全构成隐患。近年来，乳酸菌因有益作用而受到关注。乳酸菌具有丰富的酶系，有些可产生外肽酶。然而，国内外用乳酸菌改善蛋白酶解物的风味鲜有研究。

本研究采用蛋白酶酶解-乳酸菌发酵联合处理制备乳清蛋白酶解物，采用气相色谱-质谱联用仪对乳清蛋白酶解物经乳酸菌发酵前、后的挥发性风味物质进行分析和鉴定。利用小鼠脾淋巴细胞模型评价乳清蛋白酶解物的免疫调节活性，为乳清蛋白酶解物的工业化应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳清蛋白浓缩物（Hilmar，WPC-8200），北京银河路经贸有限公司；中性蛋白酶（0.8 AU/g），诺维信（中国）生物技术有限公司；YO-MIX 300 发酵剂（由嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌组成），丹尼斯克有限公司；RPMI-1640 培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素，美国Invitrogen 公司；红细胞裂解液、噻唑兰 （Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）、二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、磷酸盐缓冲液，北京索莱宝科技有限公司；刀豆蛋白A （Concanavalin A，ConA），美国Sigma 公司；其余试剂均为分析纯级，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

YP5002 型电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司；JJ-1 型精密定时电动搅拌器，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；DK-8D 型电热恒温水浴槽，上海一恒科技有限公司；LGJ-12 型真空冷冻干燥机，北京松原华兴科技仪器有限公司；MCO-17AC 型二氧化碳培养箱，日本三洋公司；FE20 型pH 计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；LC-15C 型高效液相色谱，日本岛津公司；ZDX35BI 型高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；iMarkTM 酶标仪，美国伯乐公司；7890B-5977B 型气相色谱质谱联用仪，安捷伦科技（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白酶解物及其发酵产物的制备 称取一定质量乳清蛋白，制成质量浓度为5 mg/mL的乳清蛋白溶液，加入质量分数5%中性蛋白酶（与底物比），在55 ℃、pH 7.0 条件下酶解3 h。酶解结束时在85 ℃条件下加热20 min 灭酶，冷冻干燥得到乳清蛋白酶解物。

将灭酶后未冻干的乳清蛋白酶解物于超净台内分装至无菌试管中（10 mL/管），接入质量分数5% YO-MIX 300 发酵剂（与底物比）发酵3 h，冷冻干燥后即为乳酸菌发酵的乳清蛋白酶解物。

1.3.2 乳酸菌发酵前、后乳清蛋白酶解物的挥发性风味物质分析 采用气相色谱-质谱联用仪（Gas chromatography and mass spectrometry，GCMS）进行挥发性风味物质检测，参照Zhao 等[14]的方法并略作修改。

称取质量约为12 g 未经冷冻干燥的样品放入样品瓶中，于55 ℃水浴锅中平衡20 min，然后顶空吸附40 min 进行固相微萃取。

色谱条件为：石英毛细柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），进样口温度250 ℃，载气（He）流速1.0 mL/min，以1∶5 分流进样。程序升温的初始温度40 ℃保持5 min；以3 ℃/min 升温到110 ℃，保持10 min；再以4 ℃/min 升温到150 ℃，保持10 min；最后以10 ℃/min 升温到210 ℃，保持15 min。

质谱条件为：四极杆质谱仪，检测器温度为280 ℃，电子轰击离子源，电子能量为70 eV，电子倍增电压为1 353 V，离子源温度为230 ℃，四极杆温度为150 ℃，质量扫描范围50～550 amu。

采用Agilent GC-MS 色谱工作站软件进行数据处理。

1.3.3 脾淋巴细胞增殖活性测定 参照Mao 等[15]的方法并略作修改。将小鼠处死取脾制成2×106个/mL 的脾细胞悬液，加入到96 孔板中。加样方式如下：

1）阴性对照 100 μL 脾细胞悬液+20 μL 磷酸盐缓冲液

2）阳性对照 100 μL 脾细胞悬 液+10 μL ConA 溶液（5 μg/mL）+10 μL 磷酸盐缓冲液

3）试验组 100 μL 脾细胞悬液+10 μL ConA溶液（5 μg/mL）+10 μL 样品

试验孔均设5 个重复，混合均匀后将96 孔细胞培养板放入5% CO2培养箱中37 ℃培养48 h，之后每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），继续培养4 h，离心弃去上清液，将每孔加入200 μL DMSO，摇床孵育10 min，检测波长570 nm 处的OD 值。用刺激指数来表示免疫调节活性，刺激指数值越大表明免疫调节活性越强，计算公式为：

1.3.4 分子质量分布测定 采用高效液相色谱法进行测定[16]。将乳酸菌发酵的乳清蛋白酶解物配置成2 mg/mL 的溶液，用0.22 μm 过滤器过滤。检测条件：流动相A 为体积分数0.1%的冰醋酸溶液，流动相B 为含有体积分数0.1%冰醋酸的乙酸，A 相与B 相的比例为55∶45；流速为0.5 mL/min；进样量为25 μL；检测波长为214 nm；柱温为40 ℃；色谱柱型号为TSK 凝胶G2000 SWXL 柱（7.8 mm×300 mm，0.5 μm）。以细胞色素c、抑肽酶、胰岛素氧化B 链、杆菌肽、Trp-Pro-Trp-Trp、Asn-Cys-Ser、Gly-Sar 为标准品制作校准曲线。

1.4 数据处理与分析

除特别说明外，结果以平均值±标准差的形式表示。用SPSS 17.0 统计软件对数据进行单因素方差分析，P＜0.05 时为差异性显著；用GraphPad Prism 7.00 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌发酵前、后乳清蛋白酶解物的挥发性风味物质鉴定

乳清蛋白、乳清蛋白酶解物及乳酸菌发酵的乳清蛋白酶解物的挥发性风味物质的GC-MS 总离子色谱图如图1所示，共检测出26 种挥发性风味物质（表1），主要是酯、醇、酮、酸、酚（图2）。乳清蛋白中共检测出10 种挥发性风味物质，包括酯类3 种、醇类1 种、酸类2 种、酚类1 种和其它3种，其中酸类物质占比最高，相对含量为35.36%；乳清蛋白酶解物中共检测出14 种挥发性风味物质，包括酯类2 种、醇类1 种、酮类4 种、酸类1种、酚类2 种和其它4 种。与乳清蛋白相比，乳清蛋白酶解物中酮类和酚类物质的相对含量上升，酸类物质的相对含量下降，仅为13.33%。乳酸菌发酵的乳清蛋白酶解物中共检测出10 种挥发性风味物质，包括酯类2 种、醇类1 种、酮类2 种、酸类4 种和其它1 种，与乳清蛋白酶解物相比，乳酸菌发酵的乳清蛋白酶解物中酯类和酸类物质的相对含量升高，酮类和酚类物质的相对含量下降。由以上结果可以看出乳清蛋白、乳清蛋白酶解物以及乳酸菌发酵的乳清蛋白酶解物，无论是挥发性风味物质的种类还是数量都存在明显差异。

表1 乳酸菌发酵前、后乳清蛋白酶解物中的挥发性风味物质Table 1 Volatile flavor compounds in whey protein enzyme hydrolysate before and after lactic acid bacteria fermentation

图1 挥发性风味物质的GC-MS 总离子色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of volatile flavor compounds

图2 乳酸菌发酵前、后乳清蛋白酶解物中挥发性风味物质的相对含量Fig.2 Relative content of volatile flavor compounds in whey protein enzyme hydrolysate before and after lactic acid bacteria fermentation

酯类物质通常具有芳香气味，虽然乳清蛋白及其酶解物的酯类物质相对含量差异不大，但种类不同，具有香甜味的肉豆蔻酸甲酯在酶解后消失，可能会造成体系香甜味减弱。醇类物质通常具有芳香、植物香以及酸败等气味[17]，阈值较高，本研究中鉴定出的醇类物质相对含量较低，对体系整体风味的贡献不大。2-庚酮、2-壬酮等甲基酮类具有令人愉悦的水果味及奶油味，乳清蛋白酶解物中甲基酮类物质相对含量较高，因此，酶解导致的风味变化并不全是负面的。酸类是乳清蛋白中主要的挥发性风味物质，酶解后酸类物质的相对含量下降。乳清蛋白酶解物中酚类物质的相对含量高于乳清蛋白，6-姜酚具有不愉快的辛辣气味[18]，可能会带来腥味。此外，乳清蛋白酶解物中还产生了苯并噻唑，其气味类似于喹啉，可能是长时间加热酶解及高温灭酶时发生美拉德反应产生的副产物[19]。综上所述，酶解后出现的不良风味可能是不同酯、酮、酸、酚等多种物质共同作用的结果。

乳清蛋白酶解物经乳酸菌发酵后酸类物质的相对含量提高，种类也更丰富，这是发酵过程中乳酸菌代谢作用的结果[20]。正癸酸是构成酸乳主体风味的物质之一[21]，本研究发现经乳酸菌发酵后乳清蛋白酶解物中产生了正癸酸，相对含量为9.20%，会给体系带来类似酸乳的良好风味；发酵后产生的月桂酸有清香味，也会对体系的整体风味起积极作用。曾少葵等[22]发现嗜热乳链球菌和保加利亚乳杆菌混合发酵的罗非鱼下脚料酶解液中挥发性风味成分增加了酯类、辛酸及十六醛等，酶解液腥味减弱。大豆分离蛋白经瑞士乳杆菌发酵后苦味和腥味也减弱[23]。本研究所用发酵剂由嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌组成，在酶解乳清蛋白体系中，这2 种乳酸菌都能产生肽酶进一步水解苦味肽，从而使乳清蛋白酶解物的苦味下降.此外，发酵过程中产生的酸类物质也对酶解物的苦味和腥味有掩蔽作用。因此，乳酸菌发酵能够改善乳清蛋白酶解物的风味。

2.2 乳酸菌发酵前、后乳清蛋白酶解物的免疫调节活性

2.2.1 不同质量浓度乳清蛋白酶解物对小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响 不同质量浓度乳清蛋白和乳清蛋白酶解物的脾淋巴细胞增殖活性如图3所示。在0～2 000 μg/mL 质量浓度范围内，乳清蛋白酶解物的免疫调节活性呈现先上升后下降的趋势，这与文献报道的其它蛋白酶解物的双向免疫调节作用相符[24-25]。与对照组相比（即样品质量浓度为0 μg/mL），乳清蛋白仅在质量浓度为62.5 μg/mL 和250 μg/mL 时显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖 （P＜0.05）。乳清蛋白酶解物在质量浓度31.25～1 000 μg/mL 范围内均能显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖，当质量浓度为250 μg/mL 时，刺激指数值达到最大值，为1.45±0.06。故本研究选择

图3 不同质量浓度乳清蛋白酶解物的免疫调节活性Fig.3 Immunomodulatory activity of whey protein enzyme hydrolysate at different mass concentrations

250 μg/mL 作为后续酶解物的添加质量浓度。

2.2.2 乳酸菌发酵前、后乳清蛋白酶解物的免疫调节活性对比 乳酸菌发酵前、后乳清蛋白酶解物的脾淋巴细胞增殖活性如图4所示。从图中可以看出，与乳清蛋白相比，发酵前、后的乳清蛋白酶解物均能显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖（P＜0.05），且两者之间没有显著性差异（P＞0.05），结果表明乳酸菌发酵未对乳清蛋白酶解物的免疫调节活性造成影响。

图4 乳酸菌发酵前、后乳清蛋白酶解物的免疫调节活性Fig.4 Immunomodulatory activity of whey protein enzyme hydrolysate before and after lactic acid bacteria fermentation

2.3 乳酸菌发酵后乳清蛋白酶解物的分子质量分布

经乳酸菌发酵后乳清蛋白酶解物的分子质量分布如图5所示。从图中可以看出，酶解物中分子质量小于0.5，0.5～1，1～2，2～3，3～4，4～5，5～10 ku 和大于10 ku 的多肽分别占11.30%，28.13%，10.79%，15.85%，7.15%，6.41%，15.50%和4.87%。已有研究表明，多肽的分子质量范围在0～3 ku 时免疫调节活性更强[26]，而本文中经乳酸菌发酵的乳清蛋白酶解物中分子质量小于3 ku的多肽占66.07%，说明活性肽能从蛋白质一级结构中有效释放。

图5 乳酸菌发酵后乳清蛋白酶解物的分子质量分布Fig.5 Molecular weight distribution of whey protein enzyme hydrolysate after lactic acid bacteria fermentation

3 结论

与乳清蛋白相比，乳清蛋白酶解物的酯类和酸类物质相对含量减少，具有腥味等不良气味的物质相对含量增加，而乳酸菌发酵处理可以增加乳清蛋白酶解物中酸类物质的相对含量和种类，给其带来类似酸乳的良好风味，起到改善风味的作用。与乳清蛋白相比，乳清蛋白酶解物的免疫调节活性显著升高，且乳酸菌发酵未对其免疫调节活性造成不利影响。研究结果证明经乳酸菌发酵处理获得的乳清蛋白酶解物的风味得到改善且具有免疫调节活性，为其产业化应用提供了科学依据。