大肠杆菌谷氨酸脱羧酶A的基因克隆与表达及其酶学性质

于 平，刘 航，朱鹏志，胡淳玉，杨柳贞，贺 敏，马 健

（浙江工商大学食品与生物工程学院 杭州 310018）

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，GABA）是一种非蛋白质氨基酸[1]，最初是在马铃薯块茎组织中发现的[2]。在微生物中，γ-氨基丁酸参与了芽胞杆菌的孢子萌发过程[3-5]。大肠杆菌、乳酸菌、单增李斯特菌和分枝杆菌等部分细菌还可利用γ-氨基丁酸来抵抗酸性环境[6-8]。

目前，γ-氨基丁酸作为一种生物活性因子广泛应用于食品和制药工业中。它可以作为一种功能因子添加到食品中，如奶酪、茶和面包的制作过程中经常添加γ-氨基丁酸[9-11]。在制药工业中，γ-氨基丁酸作为哺乳动物中枢神经系统的主要抑制性神经递质，可改善大脑内血浆和生长激素的浓度以及蛋白质的合成[12]。口服γ-氨基丁酸还能显著降低血压和治疗神系统经障碍[13]。Hagiwara 等[14]的报道称γ-氨基丁酸作为胰岛素的强分泌剂，可有效预防糖尿病。γ-氨基丁酸的摄入也可以调节疼痛和焦虑以及血清和脂质水平[15-16]，抑制癌细胞增殖[17]，提高记忆力和学习能力[16]。

由于γ-氨基丁酸的诸多有益功能和日益增长的商业需求，越来越多的学者尝试通过化学或生物法制备γ-氨基丁酸[17-19]。由于生物法具有反应过程简单、催化效率高、反应条件温和和环境相容性好等优点，目前已成为制备γ-氨基丁酸的主要方法[20]。γ-氨基丁酸可由谷氨酸脱羧酶（GAD）催化谷氨酸脱羧制备（图1）[1，21]，因此研制高校廉价的谷氨酸脱羧酶是生物法制备γ-氨基丁酸的关键。

图1 L-谷氨酸脱羧制备γ-氨基丁酸Fig.1 Preparation of γ-aminobutyric acid by L-glutamate decarboxylation

谷氨酸脱羧酶能催化谷氨酸和谷氨酸盐的α-脱羧反应合成γ-氨基丁酸[1]。它是一种磷酸吡哆醛依赖型酶，包括谷氨酸脱羧酶A（GadA）和B（GadB）2 个亚基[3]。据报道，谷氨酸脱羧酶广泛存在于哺乳动物的大脑、植物和微生物中[22]。来源不同的谷氨酸脱羧酶，在酶学性质上存在一定的差异。目前许多学者已经从植物[23]、大肠杆菌[24]、曲霉[25]和乳酸菌[26]中成功分离了谷氨酸脱羧酶，并对其性质进行了研究。例如，Ueno 等[27]从短乳杆菌中分离纯化了谷氨酸脱羧酶，并测定其生化特性。Park 等[28]报道从新分离的短乳杆菌中克隆了编码谷氨酸脱羧酶的基因。Nomura 等[29]对谷氨酸脱羧酶进行了分离鉴定，并克隆了乳酸乳杆菌中含有的一个编码谷氨酸脱羧酶的基因。Kim 等[30]对来源于短乳杆菌BH2 的谷氨酸脱羧酶的酶学性质进行了研究，并发现该酶的一些抑制剂。另外，人们从玉米胚[31]、豆豉[32]和发芽粟谷[33]等植物中分离出谷氨酸脱羧酶，并对其酶学性质进行研究。遗憾的是，天然来源的谷氨酸脱羧酶催化效率低，稳定性差，难以实现大规模工业化应用。

鉴于此，本研究首先从大肠杆菌中克隆编码谷氨酸脱羧酶A 的基因gadA，并构建表达载体pET28a-gadA，然后将该载体转化至大肠杆菌BL21（DE3），成功筛选能高效表达谷氨酸脱羧酶A 的重组大肠杆菌菌株大肠杆菌BL21/pET28agadA。将该菌株诱导表达后，采用Ni2+亲和层析分离纯化谷氨酸脱羧酶A，进一步研究其酶学性质，包括最适温度、最适pH 值、温度稳定性和金属离子对酶活的影响，为深入理解谷氨酸脱羧酶A 的酶学性质及γ-氨基丁酸的制备提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大肠杆菌DH5α 和BL21 购自美国英杰生物技术有限公司，其中大肠杆菌DH5α 用于构建克隆载体和表达载体，大肠杆菌BL21 用于编码谷氨酸脱羧酶A 的基因gadA 的表达；质粒pET-28a（+）购自美国Novagen 公司，用于构建表达载体；质粒pTrc99a-gadABC 由本实验室构建[34]，携带谷氨酸脱羧酶基因gadA，gadB 和谷氨酸/γ-氨基丁酸反向转运蛋白基因C。

PCR 产物纯化试剂盒、DNA 片段纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、大肠杆菌DH5α 感受态细胞制备试剂盒、PrimeSTAR HS DNA 聚合酶、核酸胶回收试剂盒、限制性核酸内切酶BamHI 和SacI，日本TaKaRa 生物工程有限公司；DNA 聚合酶、限制性内切酶、DNA Ladder Marker、琼脂糖凝胶电泳缓冲液、T4DNA 连接酶、蛋白质Marker、Ni2+-IDA 琼脂糖纯化树脂，牛血清白蛋白定量检测试剂盒、透析袋，上海生工生物工程有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂粉、卡那霉素、丹磺酰氯、咪唑、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），杭州汇普生物化学有限公司；蛋白电泳试剂，上海至源叶生物工程有限公司；L-谷氨酸钠，上海国药集团化学试剂有限公司；γ-氨基丁酸标准品，Sigma 公司。

1.2 仪器与设备

2K15 型高速低温离心机，SIGMA 公司；YXQLS-5011 压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SDS-PAGE 电泳系统，北京市六一仪器厂；Gel Doc XR+凝胶电泳仪，BIO-RAD 公司；STS-2 脱色摇床，北京市六一仪器厂；DHL-B电脑数显定时恒流泵、BZS-100 型自动部分收集器、层析柱，上海沪西分析仪器有限公司；电热恒温水槽，上海精宏实验仪器有限公司；AF-10 制冰机，SCOTSMAN 公司；UV-2550 紫外-可见光分光光度计，SHIMADZU 公司。

1.3 培养基

1）LB 液体培养基 酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，pH 7.0。

2）LB 固体培养基 向LB 液体培养基中加入15 g/L 的琼脂粉。

3）发酵培养基 向LB 液体培养基中加入不同浓度的L-谷氨酸钠。

4）SOC 培养基 胰蛋白胨20 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠0.5 g/L，氯化钾2.5 mmol/L，氯化镁10 mmol/L，葡萄糖20 mmol/L。

1.4 牛血清白蛋白标准溶液及缓冲液

1）0.1 mg/mL 牛血清白蛋白标准溶液 准确称取1 mg 牛血清白蛋白，充分溶解于0.15 mol/L NaCl 溶液中，定容至10 mL。

2）平衡缓冲液 20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L 氯化钠，20 mmol/L 咪唑，pH 8.0。

3）结合缓冲液 20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L 氯化钠，10 mmol/L 咪唑，pH 8.0。

4）洗脱缓冲液 20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L 氯化钠，250 mmol/L 咪唑，pH 8.0。

1.5 试验方法

1.5.1 质粒pTrc99a-gadABC 的提取 采用质粒提取试剂盒提取质粒pTrc99a-gadABC，具体步骤参照试剂盒使用说明书。

1.5.2 谷氨酸脱羧酶基因A 的克隆 根据Gen-Bank 报道的谷氨酸脱羧酶A 的基因序列，设计引物F1-gadA：5’-TCGCGGATCCATGGACCA GAA GCTGTT-3’ 和R1-gadA：5’-CTTCGAGCTCTTAG GTGTGTTTAAAGCT-3’，进行目的基因的PCR 扩增，其中划线部分分别为限制性内切酶BamHI 和SacI 的酶切位点。PCR 反应体系为：5×HS 缓冲液10 μL，模板DNA 2 μL，引物F1-gadA 1 μL，引物R1-gadA 1 μL，dNTP 混合物4 μL，Prime Star HS DNA 聚合酶0.5 μL，双蒸水补足反应体系至50 μL。PCR 的反应条件为：95 ℃预变性10 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸 （Prime Star HS DNA 聚合酶的延伸速率为1 kb/min，延伸时间根据目的基因长度确定），35 个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

PCR 扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。若所需要的目的条带明亮且无杂带，可直接进行PCR 产物回收；若条带不单一，则进行割胶回收。PCR 产物回收的具体步骤参照日本TaKaRa 生物工程有限公司的DNA 纯化试剂盒使用说明书。

1.5.3 重组质粒pET28a-gadA 的构建与转化将回收的PCR 产物和质粒pET-28a（+）用限制性内切酶BamHI 和SacI 双酶切，酶切体系如下：目的基因片段gadA 或质粒pET28a（+）10 μL，酶切缓冲液2 μL，限制性核酸内切酶BamHI 和SacI各1.5 μL，双蒸水5 μL。将上述反应体系放置于37 ℃水浴中酶切3 h 后，用DNA 纯化试剂盒对上述2 种酶切产物进行纯化回收。

将纯化回收后的产物进行连接，连接体系如下：目的基因片段gadA 酶切产物6 μL，质粒pET28a（+）酶切产物2 μL，连接缓冲液1 μL，T4DNA 连接酶1 μL。将连接体系置于16 ℃金属浴中连接12 h，连接产物转化至大肠杆菌DH5α 感受态细胞中[35]。

大肠杆菌DH5α 感受态细胞的制备参照日本TaKaRa 生物工程有限公司的大肠杆菌感受态细胞制备试剂盒说明书。向制备的感受态细胞中加入10 ng 重组质粒DNA，轻轻混匀后于冰上放置30 min 后，取出样品，并置于42 ℃水浴中热激40 s。热激后的样品于冰浴中放置2 min，然后加入1 mL 37 ℃预热的SOC 培养基，37 ℃摇床培养1 h。取适量培养液涂布于筛选平板上，于37 ℃培养箱中培养24 h，获得重组菌株大肠杆菌BL21/pET28a-gadA。

1.5.4 谷氨酸脱羧酶A 的诱导表达 按体积分数2%的接种量接种重组菌株大肠杆菌BL21/pET28a-gadA 至5 mL LB 培养基中 （含100 μg/mL 的氨苄青霉素），37 ℃、220 r/min 摇床培养24 h。再按体积分数2%的接种量转接至装液量为50 mL/250 mL 的LB 液体培养基（含100 μg/mL 的氨苄青霉素）中，37 ℃、200 r/min 培养至OD600nm值为0.6 时，向培养基中加入终浓度为1 mmol/L 的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，并将摇床温度调至30 ℃，诱导培养8 h 后，收集菌体。

1.5.5 粗酶液的制备和镍柱纯化 将离心收集的菌体用蒸馏水洗2 次，重悬于10 mL 裂解缓冲液中 （50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L 氯化钠，10 mmol/L 咪唑，1 g/L 溶菌酶，pH 8.0），在冰上放置30 min，期间轻轻旋转2 次；细胞裂解液在4 ℃、15 000 r/min 离心30 min，取上清液；将镍螯合层析柱颠倒混匀树脂，并排除贮存缓冲液，将上清液加入镍柱，弃流出液；用4 mL 漂洗缓冲液（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L 氯化钠，20 mmol/L咪唑）洗柱2 次，去除杂蛋白；用1 mL 漂洗缓冲液（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L 氯化钠，250 mmol/L 咪唑，pH 8.0）洗柱2 次，收集含谷氨酸脱羧酶A 的洗脱液。

1.5.6 重组谷氨酸脱羧酶A 的酶学性质

1.5.6.1 pH 值对酶活的影响 配置不同pH 值的酶活测定缓冲液：0.2 mol/L Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，10 mmol/L 谷氨酸钠，1 mmol/L 磷酸吡哆醛，分别在pH 3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0 下，于37℃水浴中反应10 min 后立即置于沸水浴中终止反应，测定样品中谷氨酸脱羧酶A 的酶活力，以其中最高酶活为100%。

1.5.6.2 反应温度对酶活的影响 取50 μL 适当稀释的纯酶液，加入到预热的1 mL 酶活测定缓冲液中，分别在20，30，37，40，50 ℃和60 ℃水浴中反应10 min，测定样品中谷氨酸脱羧酶A 的酶活力，以其中最高酶活为100%。

1.5.6.3 金属离子对酶活的影响 向反应体系中加入金属离子Cu2+，Ca2+，Mg2+，Ba2+，Co2+和Zn2+，使其终浓度为1 mmol/L。在最适作用pH 值和最适反应温度下，研究金属离子对谷氨酸脱羧酶A 的酶活力的影响，以不加金属离子的相对酶活为100%。

1.5.6.4 酶的热稳定性研究 取1 mL 适当稀释的纯酶液，分别置于40，50，60 ℃和70 ℃条件下保温30，60，90，120 min 和150 min，测定不同时间段的谷氨酸脱羧酶A 的酶活力。重组谷氨酸脱羧酶A 在各自温度下的初始酶活均设定为100%。

1.6 分析方法

1.6.1 蛋白质质量浓度标准曲线的绘制 样品中蛋白质含量的测定采用BCA 法，以牛血清白蛋白为标准品[36]。准确称取100 mg 牛血清白蛋白，充分溶解于磷酸缓冲溶液中，定容至100 mL，即得1 mg/mL 的牛血清白蛋白（BSA）标准溶液。按照表1分别配置不同质量浓度的蛋白标准溶液。取20 μL 相应质量浓度的标准蛋白质溶液加入到酶标板上，立刻加入200 μL 牛血清白蛋白工作液，迅速混匀，在37 ℃水浴中保温30 min，冷却至室温，测定样品在波长562 nm 处的吸光值，0 号管为对照，绘制蛋白质质量浓度标准曲线。

表1 不同质量浓度标准蛋白溶液的配制Table 1 Preparation of different mass concentrations of standard protein solution

1.6.2 样品中蛋白质含量的测定 在酶标板上加入20 μL 样品溶液（蛋白浓度过高可适当稀释），立即加入200 μL 牛血清白蛋白工作液，迅速混匀，在37 ℃水浴中保温30 min，冷却至室温后，在酶标仪上测其在波长562 nm 处的吸光值，对照组加入20 μL 磷酸缓冲液，根据蛋白质质量量浓度标准曲线方程，计算酶液中的蛋白质含量。

1.6.3 琼脂糖凝胶电泳 称取0.2 g 琼脂糖加入到配制好的20 mL 1×TBE 电泳缓冲液中，电炉加热，待琼脂糖完全溶解后，冷却数分钟。将溶液倒入制胶槽，插上梳子，待凝胶完全凝固后放入到电泳槽中，将样品和6×上样缓冲液以2∶1 比例混匀后点样，在80～120 V 电压下电泳，结束后用凝胶成像仪观察条带位置。

1.6.4 蛋白质SDS-PAGE 电泳 取1 mL 细胞破碎后的上清液，加入20 μL 的5×上样缓冲液，并加入80 μL 蒸馏水，震荡离心管将样品混匀。沸水浴煮沸5 min。用微量进样器取15 μL 裂解后的粗酶液上样。电泳时浓缩胶电压为70 V，分离胶电压为110 V。待溴酚蓝指示带跑到胶板底端时结束电泳。用考马斯亮蓝染色液染色30 min，再用脱色液快速脱色40 min，最后将凝胶进行过夜慢脱色处理至蛋白条带清晰可见[37]。最后将凝胶置于凝胶成像仪中，拍照并观察电泳结果。

1.6.5 谷氨酸脱羧酶A 的酶活测定方法 酶活测定缓冲液配方如下：10 mmol/L 谷氨酸钠，1 mmol/L磷酸吡哆醛，0.2 mol/L Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，pH 4.5[38]。取50 μL 酶液，加入到1 mL 预热的酶活测定缓冲液中，37 ℃保温10 min，然后置于沸水浴10 min 以终止反应。高效液相色谱测定反应前、后酶活测定缓冲液中生成的γ-氨基丁酸的量。酶活（U）定义：1 min 生成1 μmol γ-氨基丁酸所需的酶量为一个酶活单位。

1.6.6 γ-氨基丁酸和L-谷氨酸钠的测定 采用高效液相色谱法（HPLC）测定样品中γ-氨基丁酸和L-谷氨酸钠的含量，并采用丹磺酰氯衍生化方法[39-40]对样品进行柱前衍生化处理。采用梯度洗脱方法[41-42]对样品中的物质进行分离，梯度洗脱条件如表2所示。液相色谱分离柱为安捷伦公司生产的Zorbax Eclipse Plus C18 柱，紫外检测波长为254 nm，流速为1 mL/min，柱温控制在30 ℃。盐相为四氢呋喃、甲醇和50 mmol/L 醋酸钠缓冲液（pH 6.2）的混合液，体积比为1∶15∶84，有机相为甲醇。

表2 HPLC 梯度洗脱条件Table 2 The condition of HPLC gradient elution

1.7 数据处理和统计分析

试验结果以平均值±标准偏差表示。数据分析采用SPSS 17.0 软件，质粒绘图采用Redasoft Visual Cloning 3.2.3 软件，数据绘图采用Origin 8.5软件。

2 结果与分析

2.1 L-谷氨酸钠、γ-氨基丁酸和蛋白质质量浓度标准曲线

L-谷氨酸钠、γ-氨基丁酸和蛋白质质量浓度标准曲线如图2所示。由该图可知，L-谷氨酸钠标准曲线的线性回归方程为y=2×106x+547820，相关系数R2=0.998，x 为L-谷氨酸钠的质量浓度，y 为信号峰面积（图1a）；γ-氨基丁酸标准曲线的线性回归方程为y=5×106x+2×106，相关系数R2=0.9978，x 为γ-氨基丁酸的质量浓度，y 为信号峰面积（图1b）；蛋白质质量浓度标准曲线的线性回归方程为y=1.2663x+0.0308，其中y 表示在波长562 nm 下蛋白质的吸光度；x 表示蛋白质质量浓度，相关系数R2为0.9974（图1c）。3 条标准曲线的线性回归方程的相关系数R2均大于0.99，表明自变量与因变量之间的线性关系良好，可用作标准曲线。

图2 L-谷氨酸钠、γ-氨基丁酸和蛋白质量浓度标准曲线Fig.2 Standard curves of mass concentration of L-monosodium glutamate，γ-aminobutyric acid and protein

2.2 谷氨酸脱羧酶A 基因gadA 的克隆及其表达载体的构建

以质粒pTrc99a-gadABC 为模板，采用PCR技术克隆了编码谷氨酸脱羧酶A 的基因gadA，将gadA 基因用限制性内切酶BamHI 和SacI 双酶切后，连接到用相同限制性内切酶双酶切的质粒pET-28a（+）上，构建重组质粒pET28a-gadA，构建过程如图3所示。

图3 质粒pET28a-gadA 构建过程示意图Fig.3 Schematic map of the construction of the plasmid pET28a-gadA

将重组质粒pET28a-gadA 转化至大肠杆菌BL21，随机挑选4 个转化子进行鉴定，结果如图4所示。

图4 重组质粒P1、P2、P3 和P4 的大小（a）、PCR（b）和双酶切（c）鉴定结果Fig.4 Identification results of size （a），PCR （b）and double enzyme digestion （c）of recombinant plasmids P1，P2，P3 and P4

从抗性平板上随机挑取4 个转化子，分别提取质粒，将质粒命名为P1、P2、P3 和P4。质粒大小鉴定结果如图4a所示，pET28a 质粒大小为5 369 bp，重组质粒pET28a-gadA 大小为6 769 bp，图中P1、P2 和P3 符合预期大小。图3b 为PCR 鉴定结果，gadA 基因为1 400 bp，从图中可看出P1、P2和P3 扩增出的条带符合预期大小。从图3c 可以看出，双酶切后目的基因gadA 大小为1 400 bp，pET28a 质粒载体大小为5 369 bp，图中1、2 和3泳道分别有2 个条带，且符合预期大小。根据上述结果，可以判定质粒P1、P2 和P3 构建成功。

2.3 谷氨酸脱羧酶A 镍柱纯化

将诱导表达的重组菌大肠杆菌BL21/pET28a-gadA 进行超声破碎释放胞内蛋白后，进行镍柱纯化，分别测定其蛋白质含量和谷氨酸脱羧酶A 的酶活力，结果如表3所示。纯化后的重组谷氨酸脱羧酶A 比酶活为19 U/mg，是粗酶液的4.42 倍，得率为12.8%。

表3 重组谷氨酸脱羧酶A 纯化结果Table 3 Purification results of recombinant glutamate decarboxylase A

2.4 纯化的谷氨酸脱羧酶A 的SDS-PAGE 鉴定

纯化的谷氨酸脱羧酶A 的SDS-PAGE 鉴定结果如图5所示。从该图可以看出，纯化后重组谷氨酸脱羧酶A 为单一的蛋白条带，且其大小与理论分子质量一致，说明其为电泳纯级，可用于酶学性质的测定。

图5 纯化的谷氨酸脱羧酶A 的SDS-PAGE 鉴定结果Fig.5 SDS-PAGE identification results of the purified glutamate decarboxylase A

2.5 pH 值对谷氨酸脱羧酶A 酶活力的影响

pH 值对谷氨酸脱羧酶A 酶活力的影响如图6所示。将适量纯酶液分别在不同pH 值的缓冲体系下反应，测定重组谷氨酸脱羧酶A 的酶活力。从图中可以看出，pH 值为4.5 时，谷氨酸脱羧酶A的酶活力最高，该结果与文献报道的大肠杆菌谷氨酸脱羧酶A 的最适pH 值一致[43-44]。当pH 值在4.0～5.0 之间时，谷氨酸脱羧酶A 的相对酶活在75%以上；当pH 值为5.0～5.5 时，酶活下降较快；当pH 值为6 时，相对酶活仅为10.4%，可见谷氨酸脱羧酶的pH 值活性范围较窄，说明谷氨酸脱羧酶有较强的pH 值依赖性。

图6 pH 值对谷氨酸脱羧酶A 酶活力的影响Fig.6 Effects of pH value on the activity of glutamate decarboxylase A

2.6 反应温度对谷氨酸脱羧酶A 酶活力的影响

将适当稀释的纯酶液置于pH 4.5 的缓冲液中，在不同温度下反应，研究反应温度对重组谷氨酸脱羧酶A 酶活力的影响，结果如图7所示。从该图可以看出，重组谷氨酸脱羧酶A 的最适温度50℃，在该温度下，重组谷氨酸脱羧酶A 的酶活力比大肠杆菌最适生长温度37 ℃时的酶活力高40%。当反应温度从50 ℃升到60 ℃时，酶活力随着温度的升高逐渐降低，主要是因为酶蛋白的热变性使得部分酶活丧失所致。这与Zhao 等[38]报道的大肠杆菌W3110 的谷氨酸脱羧酶A 的最适温度一致。

图7 反应温度对谷氨酸脱羧酶A 酶活力的影响Fig.7 Effects of reaction temperature on the activity of glutamate decarboxylase A

2.7 金属离子对谷氨酸脱羧酶A 酶活力的影响

向反应体系中加入金属离子，如Cu2+，Ca2+，Mg2+，Ba2+，Co2+和Zn2+，并使其终浓度为1 mmol/L，测定金属离子对谷氨酸脱羧酶A 酶活力的影响，结果如图8所示。从该图可以看出，Cu2+在低浓度时能明显抑制谷氨酸脱羧酶A 的酶活力，使其下降到80%左右，这可能是Cu2+与谷氨酸脱羧酶A酶分子中某些官能团共价结合，影响了酶分子活性中心结构所致。Mg2+，Ba2+，Co2+在低浓度时对酶活的影响不大；Ca2+能够激活谷氨酸脱羧酶A 的酶活力。Snedden 等[45]研究发现，Ca2+是谷氨酸脱羧酶最通用的激活剂，能够激活大部分来源的谷氨酸脱羧酶的酶活力。还有学者研究发现，多数植物GAD 含有一个钙调蛋白黏合区，钙离子通过此区域来调节谷氨酸脱羧酶的活性[46]。

图8 金属离子对谷氨酸脱羧酶A 酶活力的影响Fig.8 Effects of metal ions on the activity of glutamate decarboxylase A

2.8 重组谷氨酸脱羧酶A 的热稳定性

将适当稀释纯酶液分别置于不同的温度下，每隔一定时间测定谷氨酸脱羧酶A 的酶活力，结果如图9所示。从该图可以看出，谷氨酸脱羧酶A在40，50 ℃和60 ℃保温150 min 后，相对酶活均在40%以上。谷氨酸脱羧酶A 的酶活力在40 ℃时，稳定性较好，可以保持63%的活性，然而在70℃时，其活力明显下降，保温150 min 后酶活仅能保持17.9%，这表明重组谷氨酸脱羧酶A 热稳定性不高，易于热失活。

图9 谷氨酸脱羧酶A 的热稳定性Fig.9 Thermal stability of glutamate decarboxylase A

3 结论

本研究首先以质粒pTrc99a-gadABC 为模板，采用PCR 技术克隆了编码谷氨酸脱羧酶A 的基因gadA，然后将该基因与质粒pET-28a（+）连接，构建重组质粒pET28a-gadA，并将该质粒转化至大肠杆菌BL21，成功获得能够表达谷氨酸脱羧酶A 的重组大肠杆菌菌株大肠杆菌BL21/pET28agadA。将该菌株诱导培养后，超声破碎得粗酶液。通过Ni2+柱亲和层析分离纯化出目的蛋白谷氨酸脱羧酶A，并对纯化的谷氨酸脱羧酶A 进行了SDS-PAGE 鉴定。纯化结果表明重组谷氨酸脱羧酶A 的比酶活为19 U/mg，是粗酶液的4.42 倍，得率为12.8%。谷氨酸脱羧酶A 的酶学性质研究表明，该酶的酶活力在pH 值为4.5 时最高，具有较强的pH 值依赖性。该酶的最适温度为50 ℃，在40 ℃时热稳定性最好，70 ℃时稳定性较差，此时酶活力仅为初始酶活的17.9%。Cu2+对谷氨酸脱羧酶A 的酶活力具有较强的抑制作用，Ba2+、Co2+和Mg2+对酶活力影响不大，Ca2+能显著地增加其酶活力。