正交试验法优选尿石清合剂的水提醇沉工艺

杨素红，胡玉良

(广州中医药大学附属中山中医院制剂室，中山 528400)

尿石清合剂是本院自制制剂，主治湿热下注型石淋、热淋等，用于治疗膀胱结石、肾结石、输尿管结石及泌尿系统感染。其处方主要组成为广金钱草、栀子、滑石等[1]。该方系根据本院治疗泌尿系统结石的有关资料，经临床实践应用几十年而成。由于原工艺为水提，水提液中含有多种无效成份和杂质，影响了口感和疗效。为了减少制剂的体积，提高有效成份的含量，进而将此方改为口服液。因此，需要对工艺进行改良，常用的中药净化方法为水提醇沉。栀子是方中的君药，栀子苷是栀子中活性成份，尿石清合剂质量标准中含量测定项便以栀子苷为量化指标。总固物是常用的水提工艺研究考察指标，故选取总固物重量和栀子苷含量为考察指标，采用正交试验设计方法对水提工艺进行优选。另外，醇沉是常用的中药纯化工艺，采用正交试验设计方法对醇沉工艺进行优选，以筛选最佳制备工艺，为后续该制剂的进一步研发提供参考。

1 材料

1.1 药品与试剂

栀子苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号110749-201316，含量以97.5%计)；所用药材均购于广东致信药业有限公司，经鉴定符合《中国药典》2020年版规定[2]；流动相采用甲醇为色谱纯；水为超纯水；其他试剂为分析纯。

1.2 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪[安捷伦科技(中国)有限公司]；Inertsil®ODS-3色谱柱(日本岛津公司)；BS224S电子天平[赛多利斯(北京)有限公司]。

2 方法与结果

2.1 总固物重量的测定

按处方比例称取适量的药材，加水提取，精密量取提取液25 ml，置于经105 ℃干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，置于105 ℃干燥3 h，取出，移置干燥器中放置30 min，迅速精密称定重量，计算总固物重量。

2.2 栀子苷含量的测定[3-5]

2.2.1色谱条件

色谱柱：C18色谱柱；流动相：甲醇-水(20∶80)；柱温：30 ℃；检测波长：236 nm。

2.2.2溶液制备

2.2.2.1 供试品溶液

精密量取供试品5 ml于50 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀；再精密量取5 ml于25 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀、过滤即得。

2.2.2.2 对照品溶液

精密称取5 mg的栀子苷对照品于25 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度；再精密量取2 ml于20 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.3含量测定

在上述色谱条件下，精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μl,分别注入液相色谱仪中，测定栀子苷含量。

2.3 水提工艺研究[2,6-7]

2.3.1正交试验设计

水提工艺选取加水量(A)、浸泡时间(B)、提取时间(C)、提取次数(D)为考察因素，每个因素设3个水平，按L9(34)正交设计表进行试验，以总固物重量和栀子苷含量为评价指标，因素水平选择见表1。

表1 水提工艺正交试验设计因素和水平

2.3.2试验方法与结果

称取1/10处方量药材，共9份，按表1正交试验表试验，结果见表2。

表2 水提工艺优选正交试验结果

2.3.3结果分析

由表2可知，总固物重量的影响试验因素依次为A>D>B>C，确定栀子的最佳提取条件为A3B1C2D2，即加12倍量水浸泡0.5 h，提取2次，每次1.5 h。栀子苷含量的影响因素依次为B>A>C>D，确定栀子的最佳提取条件为A3B2C3D1，即加12倍量水浸泡1 h，提取1次，提取2 h。综合考虑，最好的方案为A3B2C3D2，即加12倍量的水，浸泡 1 h，提取2次，每次2 h。

2.3.4验证试验

根据所选的最佳提取条件，进行3次验证试验。分别按照处方比例，称取药材，以较优的工艺A3B2C3D2提取，分别测定总固物重量和栀子苷含量，记录结果，见表3。

表3 水提工艺验证试验结果

总固物重量和栀子苷含量的RSD分别为0.43%和1.84%，说明该工艺科学合理，质量稳定。

2.4 醇沉工艺优选[8]

2.4.1正交试验设计

选择药液相对密度(A)、含醇量(B)、醇沉时间(C)为考察因素，每个因素设3个水平；按L9(34)正交试验表,设9次试验；取适量水提液水浴浓缩至相对密度分别为1.05、1.10和1.15，取50 ml浓缩液，于60 ℃时缓缓加入适当比例的乙醇，使其含醇量达到60%、70%和80%，搅拌均匀后分别置室温放置12、24和48 h，滤过，滤液置蒸发皿中，80 ℃水浴浓缩挥发乙醇至无醇味，按照“2.2.2.1”制备供试品溶液，测定栀子苷含量。因素水平见表4。

表4 醇沉工艺优选正交试验因素和水平

2.4.2试验方法与结果

按照优选的水提工艺制备药液，取9份，每份100 ml，按表4正交试验表进行试验，结果见表5。

表5 醇沉工艺正交试验结果

2.4.3结果分析

由直观分析可知，影响醇沉效果的因素顺序为A>C>B，由此得出的最佳工艺组合为A2B1C2，即醇沉浓度60%，药液初始相对密度1.10，醇沉时间24 h。

2.4.4验证试验

根据所选的最佳醇沉条件，进行3次验证试验，分别测定栀子苷含量，结果见表6。

表6 醇沉工艺验证试验结果

栀子苷含量保持在一个较稳定的范围内，RSD为1.16%，说明该工艺科学合理，质量稳定。

3 讨论

尿石清合剂方中含有黄酮类、环烯醚萜苷、有机酸、皂苷类、三萜类、甾体类、多糖类等多种类型化学成份。其中栀子的化学成份达100多种，有环烯醚萜类、黄酮类、有机酸酯类、多糖类、醛类、醇类、长链烷烃类等。虽然栀子的化学成份较为复杂，但目前对栀子的利用主要是从栀子中提取栀子黄色素和栀子苷[9]，临床上用于肝炎、尿路感染等。干浸膏是复方制剂中发挥临床作用的物质基础，浸膏得率的高低可在很大程度上反映出制剂工艺的优劣。因此，最终选择水提液的总固体物和栀子苷含量作为水提工艺正交试验的评价指标。

水提醇沉是常用的中药提取工艺[10]，可去除药液中淀粉、蛋白质等大分子，保留生物碱类、苷类、有机酸类、氨基酸、多糖等有效成份，提高澄明度、降低出膏率、减少患者每日服用量。本研究采用优化的水提工艺可获得干浸膏得率和栀子苷含量均较高的提取物，结合醇沉工艺除杂质，大大提高了制剂质量。优化的水提醇沉工艺可用于尿石清合剂组方药材的提取、纯化，使制剂具有更高的品质，为剂型改良和工业化大生产提供参考。

由于时间和条件所限，课题组暂未对工艺优化后的制剂疗效进行系统研究，日后可继续进行有关药效学研究和临床疗效观察，比较醇沉前后提取物的药效变化，以进一步阐明工艺优化的价值。