林下栽培灵芝多糖的提取工艺优化*

胡瑞财，汪忠华，胡华斌，蓝春宝

（浙江省龙游县林业技术推广站，浙江 龙游 324400）

灵芝（Ganoderma lucidum） 隶属于担子菌纲（Basidiomycetes） 多孔菌目 （Polyporals） 多孔菌科（Polyporaceae） 灵芝属（Ganoderma），被誉为百草之王，是中国名贵传统中药材，在我国已有2 000多年的药用历史，具有滋补强壮、扶正固本的功效[1-2]。现代临床医学研究证明，灵芝具有调节免疫、抗肿瘤、保肝解毒、抗衰老、抗神经衰弱、降血糖等功效[3-4]。关于灵芝的研究目前主要集中在化学成分、栽培、药理及临床应用等方面[5]。我国在20世纪50年代首次成功栽培灵芝并逐渐实现了灵芝规模化生产，现已成为灵芝主要的栽培和加工国[6]。浙江灵芝商品化生产始于20世纪70年代，已成为全国灵芝及孢子粉的主产区，主要集中在龙泉、庆元、莲都、武义等生态环境优越的山区[7]。

目前，我国灵芝栽培主要以袋料栽培和段木基质栽培为主[6-7]。近年来，随着人们生活水平的提高和保健意识的增强，对灵芝产品的需求呈日益增加的趋势。随着灵芝需求量的提高，栽培场地的不断扩大，新型栽培模式也在不断探索。林下仿野生栽培，将菌丝袋料或段木覆土于遮阳较好的树林下培育出芝，可有效克服栽培场地短缺、连作障碍等问题[8]，并具有产量高、生物转化率高等优点，已在浙江、福建、四川等山区林地得到推广和应用[9-10]。林下栽培灵芝作为市场获取灵芝商品原材料的主要方式之一，较其他方式栽培灵芝的优势在于较少人工干预和环境无污染的条件下自然生长，且品质好[11-12]。

多糖具有丰富的生物活性，是细胞的重要组成成分。现代药理研究表明，灵芝子实体多糖在增强免疫、降血脂、降血糖、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等方面有功效[13]。通过单因素试验和响应面试验，筛选出以热水浸提法优化多糖提取的最佳工艺参数，为林下仿野生栽培灵芝产品的开发提供理论支撑。

1 试验方法

1.1 试验材料与试剂

灵芝子实体为浙江省龙游县竹林下栽培的灵芝；葡萄糖、硫酸、苯酚、氢氧化钠、盐酸、无水乙醇均为国产分析醇，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器

20B中药粉碎机，南京邦斯特制药设备有限公司；R-201旋转蒸发器，上海申胜生物技术有限公司；DKZ-2电热恒温振荡水槽，上海福玛实验设备有限公司；UV-2600紫外分光光度计，日本岛津公司；PL602-S电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 灵芝子实体多糖的提取

灵芝子实体原料经干燥、粉碎后过筛（60目）。热水浴90℃提取1次，转速5 000 r·min-1离心10 min。取上清液浓缩至原体积的1/4后将上清液用95%乙醇醇沉 12 h，5 000 r·min-1离心 10 min。从水溶性糖溶液中分离出的多糖即为粗多糖。

1.3.2 提取条件的单因素试验

分别称取适量干燥粉碎后的灵芝子实体5 g。1） 固定温度为80℃的条件下，分别在料液比为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 的条件下提取 1 h，研究液料比对多糖提取率的影响。2）固定液料比1∶25，提取温度设置为 60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，提取1 h，研究提取温度对多糖提取率的影响。3） 固定料液比为1∶25，提取温度为80℃，分别 提取 60 min、75 min、90 min、105 min、120 min，研究提取时间对灵芝孢子多糖提取率的影响。

1.3.3 响应面法试验

运用Box-Behnken中心组合试验设计原理，确定提取温度、提取时间、料液比3个因素的水平范围，采用3因素3水平的响应面设计。试验因素水平见表1。

表1 水平因素表Tab.1 Table of the factors and levels

1.3.4 分析方法

采用苯酚-硫酸比色法[14]进行多糖含量的测定，多糖得率（Y，%） 计算公式为：

Y=c×v/m×100

式中：c为稀释样的多糖含量（g·mL-1）；v为稀释体积（mL）；m为样品干重（g）。

试验数据利用Design Expert 8.05软件进行分析和处理[14-15]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验筛选结果

2.1.1 料液比对灵芝多糖提取率的影响

料液比对提取率的影响试验结果见图1。

图1 不同料液比对灵芝多糖提取率的影响Fig.1 Effects of different solid-liquid ratio on the extraction of Ganoderma lucidum polysaccharides

由图1可知，开始随着料液比的逐渐升高，多糖提取率持续上升，于1:30时达到峰值；之后随着料液比继续增加，提取率下降。由于料液比过大，使得浓缩时间延长，多糖损失率增大，导致得率降低。因此，最佳料液比应为1:30。

2.1.2 提取时间对灵芝多糖提取率的影响

提取时间对提取率的影响试验结果见图2。

图2 不同提取时间对灵芝多糖提取率的影响Fig.2 Effects of different extraction time on the extraction of Ganoderma lucidum polysaccharides

由图2可知，提取时间在60 min～90 min，随着提取时间的延长，多糖提取率呈现相应的增长趋势，在提取时间为90 min时灵芝多糖的提取率达到峰值，之后提取率趋于稳定并略有下降。因此最佳提取时间为90 min较为合适。

2.1.3 提取温度对灵芝多糖提取率的影响

提取温度对提取率的影响试验结果见图3。

图3 不同提取温度对灵芝多糖损失率的影响Fig.3 Effects of different extraction temperature on the extraction of Ganoderma lucidum polysaccharides

由图3可知，当提取温度在60℃～90℃，随着提取温度升高，提取率不断提高，在90℃时达到峰值；之后随着提取温度升高，提取率下降。这是由于提取温度升高导致多糖分子剧烈运动，加快了多糖的溶出，因此升高提取温度有利于提高提取率。然而，温度升高到90℃后，不仅会加快提取液的损耗，且高温可能会破坏多糖结构。因此，最佳提取温度应为80℃。

2.2 响应面试验结果及分析

2.2.1 响应面试验结果

三因素选择提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C），设计响应面试验，结果见表2。

表2 响应面试验Tab.2 Experiment of response surface analysis

如表2所示，通过分析获得多元二次回归方程，其回归模型为：

对上述方程进行方差分析，结果见表3。

表3 回归模型方差分析Tab.3 Analysis variance of regression model

由表3可知，模型的决定系数R2为0.976 9，说明模型与实际试验拟合较好；P值均＜0.000 1，说明以多糖提取率为目标函数的回归方程的回归效果达到极显著水平；模型调整决定系数R2Adj为0.947 2，说明该模型符合试验要求。结果中模型失拟项P值为0.061 5，大于0.050 0，说明模型的失拟项不显著。根据显著性分析结果，料液比（A）、提取温度 （C） 对响应值影响显著 （P＜0.05），AA、BB、CC以及BC、AB的交互项对多糖提取率率的影响极显著（P＜0.01）。各个因素对多糖提取率影响大小依次为：提取时间（B） ＞料液比（A） ＞提取温度（C）。

2.2.2 响应面图形分析

分析了灵芝多糖提取率的影响因素，分别以一个因素为0水平，得到另外2个因素的交互影响效果。响应面及其等高线见图4～图6。

图4 提取时间和料液比交互影响多糖提取率的曲面图和等高线图Fig.4 Response surface and contour for the extraction of polysaccharide as a function of extraction time and solid-liquid ratio

图5 提取温度和料液比交互影响多糖提取率的曲面图和等高线图Fig.5 Response surface and contour for the extraction of polysaccharide as a function of extraction temperature and solid-liquid ratio

图6 提取时间和提取温度交互影响多糖提取率的曲面图和等高线图Fig.6 Response surface and contour for the extraction of polysaccharide as a function of extraction temperature and extraction time

由图4～图6可知，对灵芝多糖提取率的影响最显著因素为提取温度（C），其次是料液比（B），而提取时间（B）响应面弧度变化平缓，说明其对响应值影响较小。料液比（A） 与提取时间（B） 相互之间，提取时间（B） 提与取温度（C） 相互之间对多糖提取率有交互作用的影响。

2.3 验证试验

根据试验所得的结果以及二次多项回归方程，确定最佳提取条件为：提取时间68.3 min，提取温度84.6℃，料液比34.5，多糖提取率理论值可达1.94%。随后进行了灵芝子实体中多糖提取率的验证试验。在料液比、提取时间、提取温度分别选取34.5 mL·g-1、68.3 min、84.6℃的条件下进行 3次平行试验，测得多糖提取率达到1.88%、1.85%、1.90%。实际多糖提取率平均值为1.88%，达到了回归模型预测理论值96.91%。说明该模型能较好地模拟和预测灵芝子实体多糖提取率。

3 结论

以林下栽培的灵芝子实体为试验原料，考察热水浸提法中提取温度、料液比、提取时间对灵芝子实体多糖提取率的影响。在单因素试验的基础上，采用响应面分析法以及Box-Benhnken组合设计对林下栽培灵芝多糖的提取工艺进行了优化。试验结果表明，灵芝子实体中多糖的最佳提取条件为：提取时间 68.3 min，提取温度 84.6℃，料液比34.5 mL·g-1，此条件下的多糖提取率可得1.88%，结合验证试验，说明响应面分析得到的优化条件可靠。采用林下栽培灵芝，对于耕地少的山区开展林下栽培具有重要推广意义。