淡水鱼华支睾吸虫囊蚴LAMP检测方法的建立

朱海，汪奇志，孙成松，尹晓梅，汪峰峰，金郁，张世清

安徽省血吸虫病防治研究所，安徽 合肥 230601

近年来，随着经济社会的发展以及人民群众饮食方式的变化，食源性寄生虫病已成为不容忽视的公共卫生问题[1-2]，尤其作为重要食源性寄生虫病之一的华支睾吸虫病正严重危害着人民群众的身体健康[3]。2015年起，淡水鱼养殖、销售和餐饮环节监测被列入国家食品安全风险监测工作，其主要内容为监测淡水鱼华支睾吸虫囊蚴的感染情况。目前，华支睾吸虫囊蚴的检测主要依靠胃蛋白酶消化-解剖镜镜检法(以下简称消化镜检法)和PCR法，但基于囊蚴形态学特征鉴别的消化镜检法需要检验人员具有一定的检测能力和工作经验，存在漏检、误判等问题。PCR法因其敏感性高、特异性强能弥补消化镜检法的不足[4-5]，但受实验室环境及仪器设备等方面的限制，难以广泛应用于现场。作为一种新兴的分子生物学技术，近年来环介导等温扩增技术(LAMP)在科学研究和现场防治工作中越来越多地应用于各种病原体的检测[6-8]，在食品安全风险监测的一些领域中也已逐步得到应用[9-10]。本研究以华支睾吸虫ITS2基因序列为靶序列合成引物，基于LAMP技术建立了便捷、灵敏的淡水鱼华支睾吸虫囊蚴检测方法。

1 材料与方法

1.1样本来源 结合淡水鱼养殖、销售和餐饮环节华支睾吸虫监测项目，通过消化镜检法收集华支睾吸虫囊蚴样本及其他吸虫囊蚴样本。华支睾吸虫成虫由中山大学提供，日本血吸虫成虫、带绦虫成虫及蛔虫虫卵样本由安徽省血吸虫病防治研究所提供。

1.2主要试剂和仪器 TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒，2×Taq PCR Master Mix(Cat#PT102-02)购自上海莱枫生物科技有限公司，100 bp DNA marker购自上海赛百盛基因技术有限公司，胃蛋白酶购自国药集团化学试剂有限公司。其他仪器:DNA/蛋白质分析仪(Quawell)、基因扩增仪(C1000 Touch Thermal Cycler，Bio-Rad)、水平电泳仪(Mupid-2 plus，Advance)、凝胶成像系统(Universal Mood，Bio-Rad)、超微量分光光度计(P360，Implen)。

1.3实验方法

1.3.1基因组DNA的制备 使用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒提取华支睾吸虫嚢蚴及华支睾吸虫成虫、日本血吸虫成虫、带绦虫成虫、蛔虫虫卵样本DNA，并用超微量分光光度计对DNA样本的浓度进行测定备用。

1.3.2引物设计及筛选 根据华支睾吸虫核糖体第二内转录间隔区(ITS2)基因序列设计三组LAMP法的引物体系，见表1。

1.3.3反应体系及质控体系的建立 LAMP反应体系为25 μL。分别加入适量的2×反应缓冲液(RM)、FIP、BIP、Loop-F※6、Loop-B※6、F3、B3、Bst DNA聚合酶、LoopampR荧光目测检测试剂、去离子水(DW)及待测DNA模板。反应条件：温度为63～65 ℃，时间为30～60 min。结果判断：阳参出现显色反应后(反应管由黄色变为绿色)，80 ℃/10 min终止反应，观察其他标本是否有显色反应。

LAMP质控体系为25 μL。各组分用量:2×反应缓冲液(RM)12.5 μL，质控引物溶液DNA(PM DNA)2.5 μL，Bst DNA聚合酶1 μL，LoopampR荧光目测检测试剂1 μL，去离子水(DW)6 μL，质控阴参或阳参DNA 2 μL。反应条件及结果判断和LAMP样本反应体系一致。当质控体系阴参或阳参反应结果正常时，反应体系结果才有效。

1.3.4三组不同引物体系的LAMP法特异度及灵敏度验证 以华支睾吸虫成虫DNA样本和双蒸水为LAMP反应体系的阳参及阴参，以华支睾吸虫囊蚴、日本血吸虫成虫、带绦虫成虫及蛔虫虫卵DNA样本及其他吸虫囊蚴DNA样本作为参考，分别使用Cs-1、Cs-2、Cs-3三组引物体系进行LAMP特异度验证，并对比三组引物体系。

将华支睾吸虫成虫DNA样本(DNA浓度为3.33 ng/μL)连续10倍稀释，稀释后的浓度范围为3.33～3.33×10-7ng/μL，以双蒸水为阴性对照，对三组引物体系进行LAMP法灵敏度验证。

1.3.5PCR扩增检测 PCR引物序列参照《鱼华支睾吸虫囊蚴鉴定方法》(SN/T 2975-2011)，上游引物为5′-CGAGGGTCGGCTTATAAAC-3′；下游引物为5′-GGAAAGTTAAGCACCGACC-3′。PCR扩增反应体系为50 μL：DNA模板5 μL，上、下游引物各1 μL(20 μmol/L)，10×PCR缓冲液5 μL，MgCl25 μL(25 mmol/L)，dNTPs 1 μL(25 mmol/L)，Taq酶1 μL(5 U/μL)，加灭菌后的超纯水补足。反应条件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 40 s，62℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。电泳分析：取6 μL扩增产物和2 μL样本缓冲液在2%琼脂糖平板上进行电泳，利用凝胶成像系统观察扩增产物并成像，产物长度为315 bp[6-8]。

1.4数据统计分析 计算LAMP检测华支睾吸虫囊蚴的敏感性和特异性。敏感性和特异性的计算公式为：敏感性(%)=[真阳性数/(真阳性数+假阴性数)]×100%，特异性(%)=[真阴性数/(真阴性数+假阳性数)×100%]。采用Primer 5.0分析软件对敏感性和特异性进行χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1三组引物体系LAMP法特异度及灵敏度比较

2.1.1三组引物体系LAMP法特异度比较 通过消化镜检法收集6份华支睾吸虫囊蚴及7份其他吸虫囊蚴，连同华支睾吸虫成虫、日本血吸虫成虫、带绦虫成虫及蛔虫虫卵，使用三组引物体系进行LAMP法检测，结果显示：Cs-1引物体系中阴、阳性体系参考，华支睾吸虫成虫DNA和双蒸水样本都显色正常，6份华支睾吸虫囊蚴样本中4份呈阳性显色反应(包括1个弱阳性)，血吸虫成虫等其余样本为阴性不显色反应；Cs-2引物体系中阴、阳性体系参考，华支睾吸虫成虫DNA和双蒸水样本都显色正常，6份华支睾吸虫囊蚴样本全部呈阳性显色反应(包括2个弱阳性)，血吸虫成虫等其余样本为阴性不显色反应；Cs-3引物体系中阴、阳性体系参考及华支睾吸虫成虫DNA样本和双蒸水样本都显色正常，6份华支睾吸虫囊蚴样本全部呈阳性显色反应(包括1个弱阳性)，血吸虫成虫等其余样本为阴性不显色反应。见图1。

2.1.2三组引物体系LAMP法灵敏度比较 Cs-1引物体系的最低检出浓度为3.33×10-2ng/μL，Cs-2和Cs-3引物体系的最低检出浓度为3.33×10-4ng/μL。见图2。

2.1.3确定引物体系 通过对三组引物体系LAMP法特异度及灵敏度比较，最终确定Cs-3引物体系为本法的引物体系。

2.2LAMP法的检测效果评价 将通过消化镜检法确认的16份华支睾吸虫囊蚴样本及23份其他吸虫囊蚴样本，分别用PCR法和LAMP法平行检测。检测结果对比发现，LAMP法和PCR法的敏感性和特异性各均为100%，差异无统计学意义，见图3。

3 讨 论

人主要通过生吃或半生吃淡水鱼(虾)而感染华支睾吸虫，麦穗鱼、棒花鱼等是我国最主要的华支睾吸虫第二中间宿主[11]。有研究表明，淡水鱼华支睾吸虫的感染情况受到当地水系流域分布特点、自然气候条件、环境卫生状况、生活饮食习惯等多方面因素的影响[12]。安徽地区水系充足，气候湿润，居民集南北生活饮食习惯，具备华支睾吸虫病流行的条件。为此，2015年起安徽省被列为鱼源性寄生虫病监测地区之一。确定第二中间宿主—淡水鱼(虾)是否感染华支睾吸虫是防治华支睾吸虫病的重要环节。虽然目前PCR及其衍生技术在华支睾吸虫(囊蚴)检测中已经得到广泛使用，但PCR法需要在特定的实验室完成，对仪器有一定要求，并且从中间宿主体内提取满足PCR检测要求的一定浓度及纯度的DNA仍然比较困难[13-14]。

注：-为阴参；+为阳参；1～8均为华支睾吸虫成虫DNA样本，样本浓度分别为3.33、3.33×10-1 、3.33×10-2 、3.33×10-3 、3.33×10-4 、3.33×10-5 、3.33×10-6 、3.33×10-7 ng/μL。

注：A为PCR法,B为LAMP法,-为阴参；+为阳参；1、2、4、7、8为华支睾吸虫囊蚴,3、5、6为其他吸虫囊蚴。

本研究通过特异度及敏感度试验比较，最终确定Cs-3引物体系作为LAMP法的反应体系。Cs-3引物体系与Cs-1及Cs-2引物体系相比多出一组LB的环引物，在链式反应开始后对反应产物的稳定性起到了很好的作用，同时也进一步减少了反应体系中其他DNA碎片的干扰。LAMP法与PCR法检测的敏感性和特异性均为100%，但LAMP法更适用于低浓度的DNA检测，相对于PRC法对仪器有一定要求，LAMP法仅需要恒温水浴箱，因此LAMP法更适合在监测现场及基层工作时使用，配合LAMP法专用的便携式扩增仪，可以进一步确保结果的准确性。

尽管目前也有FTA-PCR法和RAA法运用于淡水鱼华支睾吸虫囊蚴检测的相关报道[15-16]，但与这类方法相比，LAMP法的运用更为成熟、广泛，且已经形成了规范化的质控体系[17-18]，便于反应体系的优化以及排除误差。但LAMP法依然存在不足，比如样本必须经过长时间消化后才能进行DNA的提取，且比消化镜检法耗时长。有文献[19-20]报道使用LAMP法检测人类粪便等样本时，已经能够缩短用时，提高检测效率，这也是笔者今后的研究方向。

综上所述，本研究成功建立了一种基于ITS2基因序列的淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴LAMP检测方法，本法敏感性高，特异性强，操作便捷，在寄生虫病监测和现场工作中具有较高应用价值。