LncRNA XIST通过海绵吸附miR-133a调控甲状腺癌细胞的增殖和凋亡*

张娜， 易茂林

(黄冈市中心医院 乳甲外科, 湖北 黄冈 438000)

甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率正逐年攀升[1]。尽管甲状腺癌患者的治疗方法有所发展，但甲状腺癌容易发生远处转移，导致患者预后生存差[2]。甲状腺癌的发生和发展是一个复杂的过程，深入了解和揭示甲状腺癌的发病机制，对于有效的诊断和治疗是必不可少的。长链非编码RNA (long noncoding RNA，LncRNA) 是长度大于200 nt的RNA分子，其不编码蛋白质，但在肿瘤基因表达水平的调控中具有重要的作用，是目前肿瘤学领域研究的热点[3-4]。多项研究表明LncRNA参与调节肿瘤细胞的增殖、分化、转移和凋亡等生物学活性[5-7]。X染色体失活基因(X inactivate-specific transcript，XISTX染色体失活基因)是LncRNA成员之一，研究报道XIST在非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌和胃癌等恶性肿瘤中表达异常[8-12]，但目前极少报道其在甲状腺癌中的表达情况和调控机制。microRNAs是一种非编码RNA，大小约22 nt[13]。据报道，miR-133a在宫颈癌、胃癌、肺癌、结直肠癌等恶性肿瘤中均表达下调[14-17]。近期，一种新的转录后调控的观点被提出，认为lncRNAs与miRNAs相互作用，作为竞争的内源性RNAs(ceRNAs)发挥作用，目前尚无研究报道XIST和miR-133a之间是否存在竞争性结合机制。本研究通过培养甲状腺癌细胞进行相应处理，探究XIST和miR-133a在甲状腺癌细胞中的表达情况和对甲状腺癌增殖、凋亡的影响机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1样本 收集2015年3月—2017年4月行切除术的49例甲状腺癌患者癌组织和癌旁组织样本，其中男29例、女20例，41～62岁、平均51.8岁。手术前，所有癌症患者均未接受化疗或放疗，所有患者均签署知情同意书。

1.1.2细胞培养 甲状腺上皮细胞系Nthy-ori 3-1和甲状腺癌细胞系TPC-1、FTC-133、SW579、WRO均购自ATCC库，细胞在含10%胎牛血清(FBS，Gibco，NY，USA)的DMEM培养基中培养。在5% CO2，37 ℃的恒温加湿培养箱中生长。

1.2 方法

1.2.1细胞分组 将TPC-1和FTC-133细胞分为对照组(Control组)、DMSO处理组(DMSO组)、XIST过表达阴性对照组(oe-NC组)、XIST过表达组(oe-XIST组)、XIST沉默阴性对照组(si-NC组)、si-XIST组(XIST沉默组)、XIST过表达阴性对照与miR-133a过表达阴性对照共转(oe-NC+NC mimic组)、XIST过表达与miR-133a过表达阴性对照共转组(oe-XIST+NC mimic组)、XIST过表达阴性对照与miR-133a过表达共转组(oe-NC+miR-133a mimic组)及XIST过表达与miR-133a过表达共转组(oe-XIST+miR-133a mimic组)。

1.2.2细胞转染 对数期TPC-1和FTC-133细胞经胰酶消化后，于转染前24 h再悬浮制备细胞悬液，然后以1×106细胞/孔的密度接种于6孔板中，孵育18～24 h，使每孔细胞融合率达到80%～90%。转染前3 h，用不含血清和抗生素的新鲜培养基代替原培养基。采用Lipofectamine 2000(Life Technologies)进行细胞转染，转染细胞培养48 h后进行进一步实验。

1.2.3MTT法检测细胞增殖 为探究LncRNA XIST对甲状腺癌细胞增殖的影响，分别培养TPC-1和FTC-133细胞，并对细胞进行XIST过表达和沉默处理，并通过MTT法检测各组细胞的增殖情况。按照Promega试剂盒的说明操作，用含10%FBS的培养基制备5×104细胞/mL的单细胞悬浮液。将悬浮液加入96孔板(200 μL/孔)中培养3～5 d。转染后，继续培养0、24、48和72 h，然后加入20 μL MTT(5 g/L)。MTT孵育4 h后去除上清液，加入200 μL二甲基亚砜溶解，用酶标仪测定490 nm处的OD值，确定细胞增殖情况。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡 细胞转染后48 h，流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。按照PI-Annexin V凋亡检测试剂盒(BD Bioscience，NJ，USA)的说明测定细胞凋亡。FACS Calibur流式细胞仪(BD Bioscience，NJ，USA)检测细胞凋亡。采用FACS-Diva软件BD Bioscience，NJ，USA)对数据进行分析。

1.2.5qRT-PCR检测LncRNA XIST和miR-133a的表达 培养甲状腺上皮细胞系Nthy-ori 3-1和甲状腺癌细胞系TPC-1、FTC-133、SW579、WRO，并通过qRT-PCR检测各细胞中LncRNA XIST和miR-133a的表达情况。用TRIzol试剂(NE0260，北京雷根生物技术有限公司，北京，中国)提取甲状腺癌细胞总RNA。利用PrimeScriptⅡ第一链cDNA合成试剂盒(TaKaRa，东京，日本)进行RNA逆转录后，通过SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)对获得的cDNA进行qRT-PCR。U6是检测miR-133a的内参，GAPDH是检测XIST的内参。用2 ΔCT法计算相对表达。引物由山根生物技术公司(中国上海)合成，引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 LncRNA XIST和miR-133a的表达

LncRNAXIST和miR-133a的表达结果显示，与癌旁组织比较，甲状腺癌组织中LncRNAXIST表达降低，miR-133a表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与甲状腺上皮细胞系Nthy-ori 3-1比较，TPC-1、FTC-133、SW579、WRO细胞中LncRNAXIST表达升高，miR-133a表达降低 ，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：(1)与癌旁组织比较，P<0.05；(2)与甲状腺上皮细胞Nthy-ori 3-1组比较，P<0.05。图1 甲状腺癌组织和细胞中LncRNA XIST和miR-133a的表达Fig.1 LncRNA XIST and miR-133a expression in thyroid carcinoma tissues and cells

2.2 XIST对甲状腺癌细胞增殖的影响

结果显示，在TPC-1和FTC-133细胞中，0、24、48、72 h 各时点，Control组、DMSO组、oe-NC组和si-NC组细胞增殖能力比较，差异无统计学意义 (P>0.05)。与oe-NC组比较，oe-XIST组TPC-1和FTC-133细胞在48 h和72 h时增殖能力均增强，差异有统计学意义(P<0.05)；与si-NC组比较，si-XIST组TPC-1和FTC-133细胞在48 h和72 h时增殖能力均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：A为TPC-1细胞0、24、48、72 h时细胞增殖情况统计分析，B为FTC-133细胞0、24、48、72 h时细胞增殖情况统计分析；(1)与oe-NC组比较，P<0.05；(2)与si-NC组比较，P<0.05。图2 XIST对甲状腺癌TPC-1和FTC-133细胞增殖的影响Fig.2 Effects of XIST on the proliferation of thyroid carcinoma TPC-1 and FTC-133 cells

2.3 XIST对甲状腺癌细胞凋亡的影响

在甲状腺癌TPC-1和FTC-133细胞中，Control组、DMSO组、oe-NC组和si-NC组细胞凋亡比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与oe-NC组比较，oe-XIST组TPC-1和FTC-133细胞凋亡比例降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与si-NC组比较，si-XIST组TPC-1和FTC-133细胞凋亡比例升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

注：A为TPC-1细胞经处理后的细胞凋亡率，B为FTC-133细胞经处理后的细胞凋亡率；(1)与oe-NC组比较，P<0.05；(2)与si-NC组比较，P<0.05。图3 XIST对甲状腺细胞凋亡的影响Fig.3 Flow cytometry detection on apoptosis of each group

2.4 miR-133a对LncRNA XIST的影响

在甲状腺癌TPC-1和FTC-133细胞中，与oe-NC+NC mimic比较，oe-XIST+NC mimic组细胞中XIST表达升高，oe-NC+miR-133a mimic组细胞中miR-133a表达升高，oe-XIST+miR-133a mimic组细胞中XIST和miR-133a表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与oe-XIST+NC mimic比较，oe-XIST+miR-133a mimic组细胞miR-133a表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

注：A为TPC-1细胞中LncRNA XIST和miR-133a的基因表达，B为FTC-133细胞中LncRNA XIST和miR-133a的基因表达；(1)与oe-NC+NC mimic组比较，P<0.05；(2)与oe-XIST+NC mimic组比较，P<0.05。图4 miR-133a对LncRNA XIST的影响Fig.4 Effect of miR-133a on LncRNA XIST

2.5 XIST通过吸附miR-133a，影响甲状腺癌细胞增殖

与oe-NC+NC mimic比较，oe-XIST+NC mimic组TPC-1和FTC-133细胞48 h和72 h时增殖能力增强， oe-NC+miR-133a mimic组TPC-1和FTC-133细胞48 h和72 h时增殖能力降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与oe-XIST+NC mimic比较，oe-XIST+miR-133a mimic组TPC-1和FTC-133细胞增殖48 h和72 h时能力降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

注：(1)与oe-NC+NC mimic组比较，P<0.05；(2)与oe-XIST+NC mimic组比较，P<0.05。图5 XIST对甲状腺癌TPC-1和FTC-133细胞在48、72 h时点细胞增殖的影响Fig.5 Effect of XIST on carcinoma cell proliferation

2.6 XIST通过吸附miR-133a对甲状腺癌细胞凋亡的影响

与oe-NC+NC mimic比较，oe-XIST+NC mimic组TPC-1和FTC-133细胞凋亡比例降低，oe-NC+miR-133a mimic组细胞凋亡比例升高(P<0.05)；与oe-XIST+NC mimic比较，oe-XIST+miR-133a mimic组TPC-1和FTC-133细胞凋亡比例升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图6。

注：A为TPC-1细胞，B为FTC-133细胞；(1)与oe-NC+NC mimic组比较，P<0.05；(2)与oe-XIST+NC mimic组比较，P<0.05。图6 XIST通过吸附miR-133a后甲状腺癌各组细胞凋亡情况Fig.6 Apoptosis of each group after XIST absorption of miR-133a

3 讨论

甲状腺癌的临床治疗策略，包括放射性碘治疗、甲状腺切除术和促甲状腺激素抑制治疗，但其疗效并不理想，患者5年生存率并不令人满意[18]。深入研究甲状腺癌的发病机制具有重要意义，可为甲状腺癌的诊断和治疗提供更有效的策略。LncRNA不编码蛋白质，但在染色质重塑、结构支架和转录基因调控等过程中具有非常重要的作用[19-21]。LncRNA XIST是研究较多的LncRNAs成员之一，XIST在多种恶性肿瘤中异常表达，并被视作肿瘤的预后标志物之一[22-24]。本研究通过培养甲状腺上皮细胞系和甲状腺癌细胞系，并检测各细胞系中XIST的表达情况，结果显示，XIST在甲状腺癌细胞系的表达均异常上调；且过表达XIST会导致甲状腺癌细胞增殖能力增强，凋亡比例显著降低；而下调XIST的表达，可显著抑制甲状腺癌细胞增殖，并促进细胞凋亡，此结果与Liu等[25]研究结果一致，此结果提示XIST的表达变化可调控甲状腺癌细胞增殖和凋亡。

近年来，多项研究发现XIST可能通过吸附microRNA，进而发挥基因表达调控作用[26]。Zhu等[27]研究报道XIST可通过竞争性结合miR-200a，加速宫颈癌的发展。Zong等[28]研究报道XIST可通过吸附miR-125b-5p，促进乳腺癌的进展。Zhang等[29]研究报道XIST通过吸附miR-200c-3p，促进乳腺癌细胞对阿霉素的耐药。本研究通过检测发现XIST可吸附miR-133a，这与Wei等报道一致[30]。进一步对细胞进行XIST和miR-133a共转染处理，并检测细胞的增殖和凋亡变化情况。结果显示，过表达miR-133a抑制甲状腺癌细胞增殖，并促进细胞凋亡；且过表达miR-133a可改善XIST对甲状腺癌细胞增殖能力的促进作用和细胞凋亡的抑制作用，此结果提示XIST通过吸附miR-133a，进而促进甲状腺癌细胞增殖，抑制甲状腺癌细胞凋亡。

综上所述， XIST过表达促进甲状腺癌细胞增殖，抑制甲状腺癌细胞凋亡。XIST对甲状腺癌细胞增殖和凋亡情况的调控可通过吸附miR-133a实现。本研究通过细胞实验，检测到XIST在甲状腺癌中的表达情况，并进一步完善XIST对甲状腺癌细胞增殖和凋亡影响的机制，为甲状腺癌的发展提供了新的思路，并为临床上治疗甲状腺提供新的理论依据。但目前本研究尚未进行更深入的机制探究，进一步探究miR-133a可能的下游靶标，且研究范畴仍局限于体外细胞实验，下一步本研究将进一步通过体内实验，验证XIST/miR-133a在甲状腺癌中的调控机制。