3种不同炮制方法对女贞子中7种化学成分变化的影响

陈进芳，翁育才

海南医学院 第二附属医院 药学部，海南 海口 570311

女贞子被《神农本草经》列为上品，来源于木犀科植物女贞Ligustrum lucidumAit.的干燥成熟果实，味甘、苦，性凉，具有滋补肝肾、明目乌发的功效，用于眩晕耳鸣、腰膝酸软、须发早白、目暗不明等症[1]。现代化学成分研究表明，女贞子中主要含有环烯醚萜苷类、苯乙醇类、黄酮类、三萜类等多种活性成分[2-3]。目前,从环烯醚萜苷类化合物中分离出来30 多种化合物，其中含量较高的有特女贞苷、女贞苷、女贞苷G13 和橄榄苦苷等裂环环烯醚萜苷类，这类化合物具有抗氧化、免疫增强、肿瘤抑制、调血脂等作用[4-6]，《中国人民共和国药典》2020 年版一部也以特女贞苷为含量测定指标；苯乙醇类中的红景天苷和酪醇为女贞子发挥疗效的重要有效成分，具有抗菌、抗炎、抗肝损伤等多种生物活性[7-8]；黄酮类化合物木犀草苷是女贞子发挥调血脂作用的主要成分，有效率高达90%[9]。临床常用其炮制品，女贞子历代炮制方法有：宋代“饭上蒸”（《疮疡经验全书》）；明代有酒浸蒸晒（《本草通玄》）、酒拌黑豆蒸9 次（《炮炙大法》）；清代有蜜酒拌蒸（《医方集解》）、盐水拌炒（《得配本草》）等；现代炮制多采用净制、酒制、盐制[10-12]。女贞子经过不同炮制工序后，其所含化学成分会发生变化，进而影响临床疗效。目前，尚无关于特女贞苷、红景天苷、女贞苷、女贞苷G13、木犀草苷、酪醇和橄榄苦苷7种化学成分经上述3种炮制方法炮制后含量的变化研究。故本研究采用多波长切换高效液相色谱法（HPLC）对经不同炮制方法炮制后女贞子中特女贞苷、红景天苷、女贞苷、女贞苷G13、木犀草苷、酪醇和橄榄苦苷含量进行测定，为女贞子饮片的质量标准提高和临床疗效提供参考。

1 材料

1.1 仪器

2695/2996 型高效液相色谱仪，包括真空脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、UV 2489 型检测器、Empower 2.0 工作站；AUW220D 型电子天平（d=0.01 mg，日本岛津公司）；YF-111 型高速中药粉碎机（瑞安市永历制药机械有限公司）；KQ-500E型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品特女贞苷（批号：111926-201906，纯度：95.0%）、红景天苷（批号：110818-201708，纯度：98.8%）、女贞苷（批号：111918-201703，纯度：94.4%）、木犀草苷（批号：111720-201810，纯度：93.5%）、酪醇（批号：111676-201802，纯度：95.9%）均购自中国食品药品检定研究院；对照品女贞苷G13（批号：PRF181216，纯度＞97.0%）、橄榄苦苷（批号：PRF1701127，纯度＞95.0%）购自成都普思生物科技股份有限公司；乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯（美国默克公司）；水为娃哈哈纯净水。

女贞子购自山东百味堂中药饮片有限公司（批号：190921），经海南医学院第二附属医院药学部方草主任药师鉴定为木犀科植物女贞Ligustrum lucidumAit.的干燥成熟果实。

2 方法与结果

2.1 炮制方法

2.1.1 净女贞子 取女贞子生品适量，除去杂质，洗净，干燥。平行制备3份样品（编号为PZ01～PZ03）。

2.1.2 盐女贞子 取净女贞子生品适量，每100 g中喷淋1%盐水20 mL，拌匀，闷润至透净。平行制备3份样品（编号为PZ07～PZ09）。

2.1.3 酒女贞子 取净女贞子生品适量,放入陶瓷锅，每100 g 中加入20 g 黄酒，拌匀，密闭闷润4 h后，保持陶瓷锅密闭,放入不锈钢蒸锅，蒸24 h。平行制备3份样品（编号为PZ04～PZ06）。

2.2 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：AgilentEclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL·min-1，柱温：28 ℃，进样量：10 μL；流动相：乙腈（A）-0.15%甲酸（B），梯度洗脱（0～20 min，10%～18%A；20～30 min，18%～35%A；30～52 min，35%～69%A；52～60 min，69%～10%A）；检测波长：224 nm（红景天苷、酪醇）、235 nm（特女贞苷、女贞苷、女贞苷G13、橄榄苦苷）、349 nm（木犀草苷）；在上述色谱条件下[10,13-14]，基线平稳，7 种化学成分色谱峰峰形较好，且与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论板数均大于5700，系统适用性良好，色谱图见图1。

图1 混合对照品及女贞子不同炮制品HPLC图

2.3 溶液的制备

2.3.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称定特女贞苷、红景天苷、女贞苷、女贞苷G13、木犀草苷、酪醇和橄榄苦苷对照品适量，用85%甲醇溶解制成特女贞苷166.13 μg·mL-1、红景天苷90.41 μg·mL-1、女贞苷40.52 μg·mL-1、女贞苷G13 92.26 μg·mL-1、木犀草苷40.85 μg·mL-1、酪醇21.07 μg·mL-1和橄榄苦苷88.93 μg·mL-1的混合对照品溶液。避光保存。

2.3.2 样品溶液的制备 分别精密称取已粉碎（过三号筛）的净制女贞子、酒女贞子和盐女贞子样品各约1.0 g，置于50 mL 具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇35 mL，称定质量，超声(功率：400 W,频率：40 kHz)提取35 min，取出，放至室温，称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，滤过，取续滤液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 线性关系考察

分别精密量取2.3.1 项下混合对照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 置25 mL 棕色量瓶中，加85%甲醇定容至刻度，摇匀，得系列混合对照品溶液，在2.2 项下色谱条件下进样分析，记录色谱图。以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，绘制各组分标准曲线，计算回归方程和相关系数（r）。结果表明：特女贞苷、红景天苷、女贞苷、女贞苷G13、木犀草苷、酪醇和橄榄苦苷在试验范围内成良好的线性关系；将对照品溶液逐级稀释后，以信噪比（S/N）约为3.0 时的质量浓度为各成分的检测限（LOD），S/N 约为10.0 时的质量浓度为各成分的定量限（LOQ）。结果见表1。

表1 女贞子7种成分的回归方程及线性范围

2.5 精密度试验

取2.3.1 项下的混合对照品溶液，连续进样6 针，记录各成分色谱峰峰面积。结果特女贞苷、红景天苷、女贞苷、女贞苷G13、木犀草苷、酪醇和橄榄苦苷峰面积的RSD 分别为0.88%、0.79%、0.91%、0.75%、0.65%、0.95%、0.59%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密称取净女贞子（编号：PZ-01）粉末适量，按2.3.2 项下方法制备净女贞子供试品溶液适量，分别于室温条件下放置0、3、6、9、12、15 h，按2.2项下色谱条件分析，记录色谱图并计算7种成分峰面积RSD。结果特女贞苷、红景天苷、女贞苷、女贞苷G13、木犀草苷、酪醇和橄榄苦苷峰面积RSD 分别为0.69%、1.01%、0.96%、0.87%、0.77%、0.71%、1.03%。表明供试品溶液在15 h内稳定。

2.7 重复性试验

精密取同一批净女贞子供试品（编号：PZ-01）粉末适量，按2.3.2项下处理方法平行制备6份，按2.2项下色谱条件分析，记录色谱图并计算7种化学成分的峰面积RSD及平均质量分数。结果特女贞苷、红景天苷、女贞苷、女贞苷G13、木犀草苷、酪醇和橄榄苦苷的平均质量分数分别为3.097 0、1.496 0、0.553 4、1.628 0、0.561 2、0.217 7、1.211 0 mg·g-1，其含量RSD 分别为1.44%、1.59%、0.98%、1.27%、1.25%、0.92%、1.13%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的样品粉末约0.5 g（编号：PZ-01），共计6 份，分别置于50 mL 棕色量瓶中，精密加入2.3.1项下特女贞苷、红景天苷、女贞苷、女贞苷G13、木犀草苷、酪醇和橄榄苦苷混合对照品溶液（质量浓度分别为0.322 1、0.159 7、0.060 4、0.173 7、0.023 2、0.060 0、0.128 9 mg·mL-1）5.0 mL，按2.3.2项下方法制备样品溶液，在2.2项下色谱条件下进样分析。结果特女贞苷、红景天苷、女贞苷、女贞苷G13、木犀草苷、酪醇和橄榄苦苷的回收率为96.28%～101.57%，RSD 分别为0.72%、1.11%、1.44%、1.14%、0.86%、0.77%和0.84%。结果见表2。

表2 女贞子7种成分的加样回收率试验结果

2.9 样品测定

分别称取净女贞子、盐女贞子和酒女贞子各3份，按2.3.2项下的方法制备样品溶液，在2.2项下的色谱条件下分别平行进样3 针，记录色谱图，按外标法计算特女贞苷、红景天苷、女贞苷、女贞苷G13、木犀草苷、酪醇和橄榄苦苷的含量。结果见表3、图2。结果显示，女贞子中7 种化学成分经过3 种炮制工艺后，含量均有变化。

表3 女贞子各成分含量测定结果

图2 女贞子不同炮制方式7种化学成分含量变化趋势

3 讨论

3.1 含量测定方法的考察

笔者在190～400 nm 对混合对照品溶液进行紫外吸收扫描，结果发现，特女贞苷、女贞苷、女贞苷G13 和橄榄苦苷在235 nm 处有最大吸收，红景天苷和酪醇在224 nm 处有最大吸收，木犀草苷在349 nm 处有最大吸收，故采用波长切换分段检测各种成分；试验考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸（0.1%、0.15%、0.3%）、乙腈-磷酸（0.1%、0.15%、0.3%）、乙腈-甲酸（0.1%、0.15%、0.3%）5 种流动相体系，结果发现，乙腈-0.15%甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱，基线平稳且7 种化学成分的色谱峰分离度良好，峰形及峰纯度均符合含量测定要求；试验同时考察了不同柱温（25、28、30 ℃）、不同品牌色谱柱（Agilent Eclipse XDB-C18、Wondasil C18、Shimadzu VP-ODS）对色谱峰的影响，最终确定本研究的色谱条件。

3.2 不同炮制工艺7种化学成分含量结果分析

表3 及图2 表明，特女贞苷、红景天苷、女贞苷、女贞苷G13、木犀草苷、酪醇和橄榄苦苷7种化学成分在女贞子经过净制及盐制2 种炮制工艺后，含量变化不明显。而酒女贞子除木犀草苷含量无明显变化外，所含化学成分发生了质变与量变，笔者通过现有的检验能力通过HPLC 图比对出在红景天苷和酪醇色谱峰中间多出1 个小峰，通过峰面积外标法计算含量，红景天苷在酒女贞子中含量最高，酪醇含量明显上升，而特女贞苷、女贞苷、女贞苷G13 及橄榄苦苷含量降低明显，下降率分别达到63.72%、77.65%、73.35%、66.74%。笔者初步分析，这与女贞子中环烯醚萜苷类多酚化合物的结构特点相关，在特女贞苷及女贞苷G13 分子中，环烯醚萜部分通过其裂环上的酯键与红景天苷相连，橄榄苦苷、女贞苷分子中，环烯醚萜部分通过酯键与酪醇或羟基酪醇等苯乙醇类化合物相连[15-16]，其性质均不稳定，长期高温闷热酯键水解断裂，加速了特女贞苷、女贞苷、女贞苷G13 及橄榄苦苷的分解，而导致其含量的下降；降解产物酪醇质量分数上升，平级上升率为66.03%。其化学转化机制见图3。女贞子中7 种化学成分的具体转化有待笔者进一步通过实验和质谱去验证。中药的化学成分是影响中药的理化性质和发挥临床疗效的重要物质基础，本实验研究比较了女贞子经3种不同炮制工序后7种化学成分变化，为女贞子临床应用采用不同炮制品提供参考，同时也为制定女贞子炮制工艺技术提供应用基础。

图3 女贞子炮制过程中主要成分的转化