聚己内酯/纳米羟基磷灰石静电纺纤维膜的制备及其生物活性

李友瑞 张子晗 熊世江 宋花蕾

1 滨州医学院附属医院 山东 滨州 256603； 2 山东大学口腔医院 山东 济南 250012

外伤、先天发育异常、肿瘤手术切除等可导致严重的颌面骨缺损，严重影响患者的发音、美观及功能[1]。目前骨缺损的修复主要采用自体骨移植、异体骨移植以及牵张成骨等技术，但常存在继发损伤、免疫排斥、塑形性差、成骨能力有限以及技术要求高等问题[2]。近年来，骨组织工程的研究为骨缺损的修复提供了新的方案选择，支架材料是骨组织工程的三要素之一，是骨组织工程研究的重点。支架材料是由促进细胞粘附的生物活性材料制备而成，应具有多孔的三维结构促进细胞迁移、增殖和分化并有足够的机械强度。羟基磷灰石是天然骨的主要无机成分，有较高的生物相容性和骨传导性，被广泛用作骨组织替代和再生的生物材料[3]，然而纳米羟基磷灰石(nanohydroxyapatite, nHA)因机械性能差、易脆等特点限制其应用。有学者尝试将纳米羟基磷灰石与生物聚合物/有机材料结合成复合形式，以克服其机械性能的劣势。近年来常用的有机材料主要有聚-L-乳酸(PLLA)、聚己内酯(PCL)、聚-L-乙醇酸(PLGA)、聚(羟基丁酸酯-共-戊酸酯)(PHBV)、纤维素和聚乙烯醇(PVA)等高分子材料，其中PCL是一种具有良好生物相容性且可生物降解的无毒聚合物[4]，广泛用于生物医学工程和药物控释等研究，然而其自身具有弱亲水性、骨诱导活性较差等特点。静电纺技术可将有机聚合物制备成具有三维结构的生物支架，制作简单，性能稳定。本研究旨在研究聚己内酯/纳米羟基磷灰石纤维膜的理化表征及其与MC3T3-E1细胞的相互作用，探讨复合纤维膜是否适合应用于骨组织工程。

1 材料与方法

1.1 主要材料与设备 聚己内酯(Sigma，美国)；纳米羟基磷灰石(麦克林，上海)；罗丹明-鬼笔环肽(Sigma，美国)；反转录试剂盒(Roche，美国)；实时荧光定量PCR试剂盒(Roche，美国)；CCK-8检测试剂(日本同仁)；碱性磷酸酶检测试剂盒(碧云天，上海)；高压电源(东文高压电源，天津)；微量注射泵(康康医疗，安徽)；扫描电子显微镜(EVO LS15，Zeiss，德国)；透射电子显微镜(HT7700，HITACHI，日本)；接触角检测仪(Harke，北京)；荧光实时定量聚合酶链反应仪(Corbett, 澳大利亚)；激光共聚焦显微镜(TCS SPE，Leica，德国)；万能力学测量仪(Instron5565，美国)；MC3T3-E1细胞(武汉大学口腔重点实验室赠送)。

1.2 实验方法

1.2.1 静电纺纤维膜的制备 常温下，2.4 g PCL溶解于5 mL DMF与7.5 mL DCM的混合溶液中，标记为纯PCL组。然后按照30%、40%(wt/wt)比例加入纳米羟基磷灰石，磁力搅拌至少8 h至完全混合均匀，分别标记为PCL+30%nHA组、PCL+40%nHA组。静电纺丝制备过程均用同一高压电源及微量泵，保持环境在适宜的温度和湿度。具体条件是：高压电压为(25±0.5)kV，静电纺丝溶液流速3 mL/h，接收板到针尖的距离为20 cm。静电纺丝成膜后，室温下收集置于真空干燥箱备用。

1.2.2 SEM及TEM检测 用导电胶将4.5 mm×4.5 mm大小的静电纺丝膜固定在金属载物台，表面喷金后，扫描电镜观察复合纤维支架的形态并计算纳米纤维的平均直径。静电纺丝纤维膜接收到有碳膜的铜网上，室温干燥备用，然后透射电镜观察。

1.2.3 拉伸强度测定 将各组纳米纤维剪成5 cm×2 cm条状，厚度0.5 mm。采用万能测试机检测器拉伸强度，测试参数为拉伸速率为10 mm/min、温度为20℃、相对湿度为50%。

1.2.4 接触角检测 纤维膜固定在载玻片上，滴加0.5 mL ddH2O，用显微镜头捕捉液滴在材料表面伸展的图像，然后用软件分析接触角的图像。

1.2.5 细胞在纤维膜的粘附及形态 接种12 h后，采用罗丹明-鬼笔环肽标记细胞骨架，4′、6-二脒-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI) 标记细胞核，采用激光共聚焦显微镜观察细胞在纳米支架的伸展及粘附情况。

1.2.6 细胞毒性检测 MC3T3-E1细胞以2×103/孔的密度接种在96孔板(已放入支架材料)，到预定时间点(1天、4天、7天)，弃原培养液，将10 μL的CCK-8液加入到孔板中，每组5个复孔，37℃孵育4 h。然后吸取上清到另一新96孔板中，利用酶标仪在450 nm下检测吸光度值(OD)。设置一个空白组(未加细胞及支架材料)，一个对照组(含有细胞，不加支架材料)。

1.2.7 碱性磷酸酶检测 将MC3T3-E1细胞按照1×105/孔的密度接种于24孔培养板(已放入支架材料)。培养基为含有诱导液的培养基，隔2天换液。诱导7天、14天、21天后，分别取样检测405 nm处的吸光度值，以PCL组为阴性对照，每个样品设三个复孔。

1.2.8 RT-PCR检测RUNX2基因表达 骨诱导7天、14天、21天时，剪碎接种有细胞的支架，Trizol提取细胞总RNA。采用逆转试剂盒将总RNA逆转录成cDNA，采用RT-PCR检测基因Runx2，引物序列为(5′-3′：CCTTCAAGGTTGTAGCCCTC，3′-5′：GGAGTAGTTCTCATCATTCCCG)。以GAPDH(5′-3′：ACTTTGTCAAGCTCATTTCC，3′-5′：TGCAGCGAACTTTATTGATG)为内参计算2-ΔΔCt值，其中ΔΔCt=(实验组目的基因Ct值-实验组内参基因Ct值)-(对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值)。每组样品设置3个复孔。

1.3 统计学方法 使用SPSS 22.0对数据行统计分析，定量数据采用均数±标准差的形式，多组定量资料的t检验对数据进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SEM及TEM结果 电镜下所示(见图1)，静电纺丝呈现无序的三维交错结构，纤维之间交错成网状。纯PCL纤维支架材料粗细较均匀，纤维表面较光滑。聚己内酯/nHA的支架有一定的团聚，表面略粗糙,其纤维支架直径略有增粗，但差异无统计学意义。3组静电纺丝纤维的直径分别为(550.90±37.43)nm、(617.18±30.17)nm、(630.02±60.53)nm。

A. PCL组；B. 30%nHA组；C. 40%nHA组。右上角为透射电镜图像。

2.2 拉伸强度及接触角结果 PCL组亲水性较差，聚己内酯/nHA支架组的亲水性明显提高,接触角小于90°(见图2)。PCL组强度最高，随nHA的增加，聚己内酯/nHA支架组的拉伸强度逐渐降低，均小于PCL组，差别有统计学意义(P<0.05)。40%nHA组拉伸强度最低，均小于其余两组，差异有统计学意义(P<0.05)；其余各组间无统计学差异(见图3)。

A. PCL组；B. 30%nHA组；C. 40%nHA组。

与PCL组比较，*P<0.05；与30% nHA组比较，#P<0.05。

2.3 细胞的粘附生长 细胞在纤维膜表面充分伸展，伪足较多(见图4)。与PCL组相比，聚己内酯/纳米羟基磷灰石组(30%nHA组、40%nHA组)细胞粘附生长的数量明显提高(P<0.05)(见图5)；聚己内酯/纳米羟基磷灰石组可明显提高细胞在支架表面的生长增殖。

A. PCL组；B. 30%nHA组；C. 40%nHA组。

与PCL组比较，*P<0.05。

2.4 CCK-8和ALP结果 CCK-8检测结果显示接种第4、7天时，聚己内酯/纳米羟基磷灰石组的OD值高于纯聚内酯组(P<0.05)，其余各组间差异无统计学意义(图6)。

与PCL组比较，*P<0.05。

ALP检测结果显示，细胞接种14天、21天时聚己内酯/纳米羟基磷灰石组的ALP水平明显高于纯聚己内酯组及空白对照组，P<0.05(图7)。聚己内酯/纳米羟基磷灰石纤维膜可促进ALP的表达。

与空白组和PCL组比较，*P<0.05。

2.5 RT-PCR结果 细胞接种7天、14天时，聚己内酯/纳米羟基磷灰石组RUNX2 mRNA的表达明显高于纯PCL组，差异有统计学意义(P<0.05)。细胞接种21天时，聚己内酯/纳米羟基磷灰石组RUNX2 mRNA的表达水平显著低于纯PCL组且有统计学差异(P<0.05)，其余组间比较无统计学意义。以上结果说明，RUNX2在MC3T3-E1细胞的成熟分化的早期高表达，在晚期低表达，这种趋势在聚己内酯/纳米羟基磷灰石组较明显。见表8。

与空白组和PCL组比较，*P<0.05。

3 讨论

静电纺丝技术基本原理是在高压电场作用下，带电液体通过电场并拉伸形成一个向收集器喷射的稀薄液体喷射流，该液体多为聚合物溶液，其中溶剂在喷射过程中蒸发，聚合物溶液连续喷射，形成连续交联的纤维支架结构，其直径一般在10 nm到10 μm之间[5]。与相分离、泡沫法、冻干法等三维支架的制备技术相比，静电纺丝制取方法具有易操作、取材方便、参数可控等优点，是制备支架材料常用的方法。已有学者使用静电纺丝技术将nHA与有机聚合物(PLGA、PVA等)结合形成三维纤维支架而nHA的活性未被破坏[6]。本研究在借鉴其他学者研究的基础，尝试将nHA嵌入PCL纤维支架，构建具有骨传导性纤维支架复合材料。 聚己内酯/纳米羟基磷灰石组直径略有变大，但差异无统计学意义。本实验采用的羟基磷灰石的直径较小(300～450 nm)，纳米羟基磷灰石在纤维内部的重叠聚集可导致纤维直径略有增大。透射电镜结果显示，聚己内酯/纳米羟基磷灰石组有明显的纳米羟基磷灰石重叠影像，纤维表面较粗糙[7]。有学者的研究表明纤维表面粗糙度的增加受纤维直径增大的影响，这与本研究的结果是一致的[8]。有学者研究指出随机取向制备nHA嵌入的纤维支架可影响支架材料表面的粗糙度，本研究采用随机取向制备纤维在一定程度增加了材料表面的粗糙度[9]。聚己内酯/纳米羟基磷灰石组的拉伸强度降低，这可能与nHA的加入引起纳米纤维连续性降低及单位面积的聚内酯的量减少有关[10]。研究表明，nHA过多可导致静电纺丝溶液的粘稠度增加，导致相同静电纺条件下更易出现纤维的断裂，从而可能导致纤维支架拉伸强度的降低[10]。

亲水性是细胞在支架材料表面粘附生长的基础，纯PCL组的纤维疏水性较强，不利于细胞的粘附生长。接触角的结果显示，在滴加液体3 min后，聚己内酯/纳米羟基磷灰石组接触角明显降低小于90°,说明其纤维膜材料润湿性好，具有良好的亲水性。这可能与纳米羟基磷灰石具有亲水性的羟基，从而导致材料的润湿性提高[10]。

聚己内酯/纳米羟基磷灰石组有利于MC3T3-E1细胞的粘附生长。一方面复合支架材料表面粗糙度较高可促进MC3T3-E1细胞在支架表面的粘附生长，这与其他学者的研究结果是一致的[11]。另一方面，纳米羟基磷灰石的加入改善复合支架材料表面的润湿性，研究表明细胞在亲水性的材料表面更容易粘附生长增殖[12]。此外，另一学者研究发现纳米羟基磷灰石可与细胞的RGD多肽结合发挥作用进而促进细胞的粘附增殖[11]。

成骨相关基因Runt相关转录因子2(RUNX2)的表达可提示MC3T3-E1细胞的增殖成熟分化情况。既往研究表明RUNX2在细胞分化过程中高表达，一旦细胞成熟后其表达水平明显降低[10]。实验结果说明聚己内酯/纳米羟基磷灰石复合支架材料可明显地促进MC3T3-E1成骨向的分化、成熟及矿化，且nHA含量越多其促进作用更显著。

本研究成功制备出富含nHA的复合聚己内酯支架材料，并对其理化表征、生物学性能及成骨性能进行检测，可见制备的材料支架具有较理想的理化表征，能够促进细胞的黏附和增殖，说明富含纳米羟基磷灰石的静电纺丝支架是一种具有良好潜能的骨组织工程支架，在后续的研究中将在动物实验中使用该复合静电纺丝支架进行骨修复，进一步验证材料的性能。