飞秒激光辅助的兔眼角膜基质透镜移植观察

郭 静 张浩润 王 锐 赵静静 付梦军

1 滨州医学院 山东 烟台 264003； 2 潍坊眼科医院 山东 潍坊 261000

已有很多学者对角膜基质透镜移植进行了多方面的探索和研究[1-2]，从冰冻状态下仪器打磨的同种异体角膜透镜、角膜基质环植入，到水凝胶材料的人工角膜透镜植入等，但因制作程序复杂及材料的稳定性差等因素，使得透镜移植临床的应用很少。近年来，飞秒激光小切口角膜基质透镜取出术(femtosecond small incision lenticule extraction，SMILE)的广泛开展为角膜基质透镜植入手术的开展提供了有利条件。将SMILE手术中取出的角膜基质透镜进行保存和再利用，充分发挥了角膜组织的潜在利用价值，不但可以增加角膜的厚度，还可以起到加固角膜生物力学的作用。应用角膜基质透镜治疗的常见疾病有：远视、角膜浅层病变、感染性角膜病引起的角膜厚度变薄或穿孔，圆锥角膜和角膜膨隆等[3-5]。但目前角膜基质透镜移植后在角膜厚度和屈光度的矫正方面变化仍存在不确定性因素，本研究应用飞秒激光辅助行兔眼的角膜基质透镜移植观察3个月，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6只新西兰大白兔，购自青岛人和顺实验动物繁育有限公司，体质量为2～2.5 kg，月龄为4～5月。所有的动物均遵循《ARVO眼科和视觉研究中动物的使用声明》的准则，本研究得到了潍坊眼科医院动物伦理委员会的支持。

1.2 手术方法 术前给予兔子耳缘静脉注射丙泊酚麻醉(3 mg/kg，起效后10 min追加初始量的1/3)后置于VisuMax全飞秒激光手术床上(Carl Zeiss Meditec，Jena，Germany)。所有兔子均采用“S”号负压锥镜，选择快速扫描模式：激光频率为500 kHz，点间距为4.5 μm，线间距2.0 μm，能量设置为135 nj。每只兔子均用飞秒激光行左眼SMILE手术，角膜帽厚度为120 μm，角膜帽直径为7.5 mm，透镜直径为6.5 mm，输入矫正的屈光度为-5.00 D，透镜基底下加厚度为10 μm，透镜中央厚度为87 μm，边切角为90°，边切口长度为2 mm。激光扫描完成后，去除负压吸引，分离角膜边切口，依次分离透镜前、后表面，最后将透镜从边切口取出，随即放入无菌平衡盐溶液(balanced salt solution，BSS)中备用。每只兔子右眼均应用飞秒激光FLAP程序制作角膜基质囊袋，角膜瓣厚度为120 μm，角膜瓣直径为7.8 mm，边切角度为90°，角膜蒂的位置为0°，角膜蒂的角度为300°。激光扫描完成后，分离角膜瓣，将浸泡在无菌BBS液里的透镜平铺于囊袋中，调整居中位，复位角膜瓣，配戴角膜绷带镜，手术结束。所有手术均由同一位技术熟练的医生完成。

1.3 术后处理和观察 所有兔子术毕行裂隙灯显微镜检查，无异常后滴1滴妥布霉素地塞米松滴眼液(典必舒，美国Alcon公司)。术后第1天起滴左氧氟沙星滴眼液(可乐必妥，日本参天制药)4次/天，用药1周；氯替泼诺混悬滴眼液(露达舒，Bausch & Lomb Incorporated)4次/天，每周减量1次，用药1个月。

所有的兔子在术前、术后1天、术后1周、术后1月、术后2个月、术后3个月行裂隙灯显微镜检查、电脑验光、眼前段照相 (Topcon,Tokyo，Japan)、Pentacam(Oculus Optikgeräte GmbH，Wetzlar，Germany)、前节OCT(AS-OCT，Visante，Carl Zeiss Meditec AG，Jena，Germany)和角膜共焦激光显微(Heidelberg Engineering GmbH，Heidelberg，Germany)检查。电脑验光、Pentacam的每次测量均由同一技术人员重复测量3次以上，中央角膜厚度、等效球镜、平均角膜曲率均取其多次测量的平均值作为每次测量的结果。术后3个月检查完毕后，采用空气栓塞法(50 mL空气耳缘静脉注射)处死兔子，随即行眼球摘除术，分离兔角膜，用40 g/L多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色，行光学显微镜观察。

2 结果

2.1 术后一般情况 术后1天角膜上皮可见干燥斑，角膜轻度水肿，透镜居中，透镜轮廓清晰，无皱褶及移位。术后1周基质水肿较前减轻，角膜上皮光滑，透镜居中。术后1月水肿完全消退，角膜透明，透镜平复在位。术后2、3月复诊，角膜透明，角膜基质透镜植入轮廓欠清(图1)。

A、B见角膜透明；C、D见术后1天角膜上皮可见干燥斑，角膜轻度水肿，透镜居中，透镜轮廓清晰，无皱褶及移位；E、F见术后1周角膜基质水肿较前减轻，角膜上皮光滑，透镜居中；G、H见术后1月水肿完全消退，角膜透明，透镜平复在位；I、J为术后2个月，K、L为术后3个月，均见角膜透明，角膜基质透镜植入轮廓欠清。

2.2 中央角膜厚度 透镜植入术前中央角膜厚度为(357.17±12.97)μm，术后1周、1月、3月分别为(433.67±12.19)μm、(423.50±13.49)μm、(417.33±12.08)μm，较术前分别增加了(76.50±16.22)μm、(66.33±4.08)μm、(60.17±11.07)μm。整体比较术前术后，P<0.001，术后1周、1月、3月分别于术前相比差异均具有统计学意义(均为P<0.05)，术后各时间点两两对比差异均不具有统计学意义(表1)。

表1 透镜植入手术前后各时间点CCT、等效球镜、角膜前后表面Km值变化

2.3 等效球镜和平均角膜曲率 等效球镜的计算公式为球镜度加上柱镜度的1/2。术前等效球镜为(0.57±1.13)D，术后1周、1月、3月的等效球镜分别为(-1.98±1.18)D、(-2.65±0.47)D、(-1.84±0.68)D，术后1周、术后1月、2月、3月分别与术前相比球镜的差值为(-2.52±1.35)D、(-3.22±1.31)D、(-2.42±0.69)D。整体比较术前术后，差异有统计学意义(P<0.001)，术后1周、1月、3月分别与术前相比差异均具有统计学意义(均为P<0.05)，术后各时间点两两相比差异均无统计学意义(表1)。

Km为角膜地形图上的平均角膜曲率。术前前表面Km为(47.80±1.02)D，术后1周、1月、3月分别(53.85±0.99)D、(52.67±1.32)D、(52.53±0.96)D，术后1周、1月、3月分别与术前相比前表面Km增加了(6.05±1.09)D、(4.87±1.69)D、(4.73±1.00)D，术前术后整体比较差异具有统计学意义(P<0.001)，术后各时间点两两相比差异均无统计学意义(图2，表1)。

术前后表面Km为(-6.18±0.15)D，术后1周、1月、3月分别为(-5.78±0.19)D、(-5.73±0.20)D、(-5.50±0.14)D，术后1周、1月、3月分别与术前相比后表面Km的差值为(0.40±0.11)D、(0.45±0.14)D、(0.68±0.15)D，术前术后整体比较差异具有统计学意义(P<0.001)，术后各时间点两两相比差异均不具有统计学意义(图2，表1)。

A、B、C、D分别为术前、透镜植入术后1周、术后1月和术后3月的兔眼的角膜地形图。

2.4 眼前节OCT检查 术后1天，角膜基质水肿，可以清晰观察到透镜的前后界面。透镜植入术后1周、1月角膜水肿较前减轻，仍可以观察到透镜的前后界面和透镜的边缘。透镜植入术后2月和3月，角膜透明，可隐约观察到透镜的后界面(图3，图中红色箭头所示部位)。

A.术前眼前节OCT图像；B. 术后1天图像，见角膜基质轻度水肿，可以清晰观察到透镜的前后界面；C、D分别为术后1周、1月图像，见角膜水肿较前减轻，仍可以观察到透镜的前后界面和透镜边缘；E、F分别为术后2月、3月图像，见角膜透明，隐约观察到透镜的后界面。

2.5 角膜共焦激光显微镜检查 透镜植入术后1周透镜界面可见高反光颗粒，大小不一；术后1月角膜细胞形态异常，细小神经纤维开始长入；术后2月角膜细胞形态接近正常，神经纤维可见粗大分支；术后3月角膜细胞形态、数量基本正常，神经纤维可见细小分支(图4)。

A. 术前兔眼的角膜共焦激光显微镜下的图像，见角膜细胞形态规则，神经纤维排列整齐；B. 透镜植入术后1周角膜图像，见透镜界面高反光颗粒，大小不一；C. 术后1月角膜图像，见角膜细胞形态异常，细小神经纤维开始长入；D. 术后2月角膜图像，见角膜细胞形态接近正常，神经纤维可见粗大分支；E. 术后3月角膜图像，见角膜细胞形态、数量基本正常，可见细小神经纤维分支。

2.6 HE染色 术后3个月，HE染色见角膜结构完整，移植的透镜在位，可观察到透镜的前后界面，纤维排列整齐，平行分布，结构清晰，与周边组织融合未见缝隙(图5)。

A. 可观察到透镜的前后界面，结构清晰，与周边组织融合未见缝隙(×40)；B. 透镜移植的界面可见正常角膜细胞，形态规则(×400)。

3 讨论

角膜基质透镜移植可以从组织结构和功能上对角膜基质进行重建，可同时解决角膜基质病变和改善屈光状态。SMILE手术的开展为角膜基质透镜植入手术的开展提供了条件。飞秒激光可精准地进行角膜透镜切削，使取出的透镜的大小和厚度都是均匀一致的。由于角膜的基质囊袋内无血管及淋巴组织，且囊袋内为无菌环境，不接触泪液及房水，因此，透镜植入术后位置居中，术后短期内就可以水肿消退，角膜透明，且发生角膜移植片排斥及角膜感染的概率微乎其微，使得基质透镜移植可以有效的开展[6-7]。

飞秒激光辅助的角膜基质透镜移植术，因角膜基质透镜和基质囊袋均由飞秒激光来完成，精确度高，无需缝合，极大降低了由缝线引起的医源性的散光和缝线诱导的排斥反应，手术感染的风险小，组织损伤小，术后恢复快。已经有前期的研究证明全飞秒角膜透镜植入的安全性、稳定性及有效性[8-12]。Ganesh[11]等的研究中应用透镜移植治疗远视和无晶体眼，角膜基质植入透镜轮廓清晰，无皱褶、透镜溶解及移位，取得满意的临床效果。Pradhan[10]等将从高度近视患者术眼中取出的角膜基质透镜植入到另一远视患者的角膜基质囊袋内，由于角膜前、后表面的变化及角膜的重塑，屈光度仅为矫正的屈光度的一半。因受到临床病例数量和疾病种类的限制，透镜移植可以矫正的屈光度目前尚没有非常可靠的参考标准。在兔眼的透镜移植手术中，-3.00 D透镜植入组，兔眼的屈光度由(3.40±0.63)D变化为(-4.10±2.67)D，-6.00 D透镜植入组中，兔眼的屈光度由(1.20±1.00)D变化为(-9.80±1.44) D，-8.00 D透镜植入组中，兔眼的屈光度由(1.85±0.68)D变化为(-10.60±1.85)D[13]。在我们的研究中，我们植入的透镜的屈光度为-5.00 D，术后3月时，矫正的屈光度为(-2.42±0.69)D，角膜前表面Km的变化量为(4.73±1.00)D，角膜后表面Km的变化量为(0.68±0.15)D。本研究认为，透镜移植对屈光度的改变需要有两个方面的关注，一是角膜前、后表面曲率的变化，二是角膜上皮厚度的重塑，就像远视术后的回退和圆锥角膜的发生是一个相似的病理变化过程。

以往矫正远视的办法有很多，例如巩膜延伸术、角膜周边切开术、自动板层角膜热成形术等，由于这些手术方式对眼睛的损伤大，预测性差，治疗效果不稳定等缺点，被临床淘汰，直到出现了PRK及LASIK术，应用准分子激光在角膜上皮下磨镶角膜的周边部，使得中央角膜曲率变陡，中央角膜屈光度增加来达到治疗远视的目的。由于被动的行成角膜中央的高曲率，其准确性和稳定性也会有一定程度的下降，存在一定程度的回退现象[14-15]。远视的治疗一般限制在6.00 D内，远视术后角膜中央曲率应控制在46.5 D内，否则造成医院性的角膜膨隆[9]。在本研究中，应用飞秒激光在角膜表面制作一个囊袋，将同体角膜基质透镜从一眼取出，植入到另一眼的角膜基质囊袋中，一方面增加角膜中央厚度，另一方面改变角膜中央曲率，增加了角膜中央的屈光度，起到了治疗远视的效果。周跃华等[9]应用角膜透镜植入治疗远视，97.3%的患者好于或等于术前最佳矫正视力，且裸眼视力大幅度提高的同时，患者的近视力也得到了很好的改善，屈光度1个月就达到稳定状态。张晶[8]用全飞秒激光基质透镜治疗中高度远视1年的观察，术后裸眼远视力、裸眼近视力、最佳矫正视力较前有明显提高，术后3月至1年，未见明显的远视屈光度的回退现象，说明透镜移植术后屈光度稳定。也有学者应用透镜移植治疗远视眼，在1年的随访中，证明了他的安全性、有效性和稳定性[4,16]。透镜移植矫正远视的原理是增加了角膜的厚度，主动增加了角膜中央的屈光力，改变了角膜的曲率，回退的概率小，临床效果好。但透镜植入手术不是简单的透镜的叠加，涉及物理学和生物学效应等相关的变化，还需要更多的研究，更大的样本量的实验数据观察。

角膜基质透镜移植在老花、圆锥角膜及LASIK术后角膜膨隆的治疗中有较好的安全性和有效性[17]。在透镜移植联合角膜交联治疗圆锥角膜3年的随访中，角膜厚度增加，角膜稳定，CDVA显著提升[18]。有学者应用透镜移植联合PTK治疗角膜营养不良，用于角膜表层透镜术，在短期的随访观察中安全有效[3]。兔子的透镜移植实验中显示透镜移植后角膜厚度显著增加，其中-3.00 D透镜移植组角膜厚度从(353±22)μm增加到(397±29)μm，-6.00 D组角膜厚度从(375±16)μm增加到(457±38)μm，-8.00 D组角膜厚度从(367±17)μm增加到(464±27)μm[13]透镜移植术后2个月，将兔眼角膜石蜡切片后观察见-3.00和-6.00植入组，透镜的前后表面已经不清晰，-8.00 D植入组透镜的边缘依然清晰。本研究认为移植术后角膜的修复与透镜的厚度有关。角膜基质透镜移植后移植的透镜可与受体角膜组织融合，透镜移植术后的角膜厚度小于单纯叠加的厚度。共焦激光纤维镜观察见透镜移植术后，透镜的前后表面可见高反光信号，考虑与手术碎屑和胶原反应有关系[13]。透镜移植术后早期可见透镜周围组织水肿，细胞活跃。透镜移植术后第10天仍有水肿。术后1月,水肿消退，活化细胞逐渐形成静息，观察神经纤维再生[19]。3个月时，透镜体与受体角膜融合，细胞外基质逐渐清除可见较厚的神经纤维。透镜植入3年的结果显示其临床的有效性和稳定性。在本研究中，透镜移植术后3个月，角膜透明，前节OCT隐约观察到透镜的后界面，共焦激光显微镜见角膜细胞形态、数量基本正常，可见细小神经纤维分支。

可见透镜移植有非常多的潜在价值，因角膜基质透镜组织来源于活体，来源丰富，可改善目前角膜材料短缺及其他手术引起的并发症等问题。应用飞秒激光在角膜表面制作一个角膜小切口，未形成角膜瓣，对角膜生物力学影响较小，且神经损伤少，能有效的避免术后干眼的发生。但角膜基质内透镜植入术作为一种新的手术方式，仍存在一些问题和不足之处，需要更长时间和更多样本的观察研究。