Ceritinib增强ABCB1过表达白血病多药耐药的作用及机制研究

钟健生 张金丽 张星 于晓阳 佃林萍

白血病是一种造血干细胞出现病变的恶性肿瘤,儿童和青少年人群多见［1］。临床治疗常以放疗、化疗、免疫治疗、靶向治疗以及骨髓移植等为主,预后和生存率均有了很大提升,但是仍有患者产生多药耐药性［2］。而腺苷三磷酸(ATP)结合盒式蛋白(ABC) 超家族在多药耐药的形成过程当中扮演着重要的角色,如ABCB1,是位于第7号染色体上由ABCB1基因所编码的糖蛋白。研究证实,ABCB1在耐药白血病细胞中存在过表达。Ceritinib是美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗非小细胞肺癌的选择性第二代间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂［3］。研究提示［4］,Ceritinib对多药耐药ABCB1表达的实体肿瘤细胞体内体外都有很好的逆转耐药活性。本研究拟通过动物实验、细胞株及体外实验观察Ceritinib是否增强ABCB1过表达白血病细胞化疗药物的疗效,现报告如下。

1 材料与方法

1.1材料 主要材料包括阿霉素、紫杉醇、顺铂、维拉帕米、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma company)；Ceritinib(美国Selleck Chemical公司)；细胞株：K562/adr细胞,K562细胞；北京维通利华公司培养5～6周龄的BALA/c-nu雌性裸鼠；流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)、酶标仪(Model 550)(美国Bio-Rad公司)、Forma 3Ⅲ CO2水套培养箱(美国Thermo公司)等。

1.2方法

1.2.1四甲基偶氮唑蓝(MTT法)检测细胞毒性 不同浓度化疗药物加或不加Ceritinib、维拉帕米。5%CO237℃孵育细胞68 h,每孔加入MTT,4 h后离心,移除培养基,加入DMSO。酶标仪检测光密度540 nm,底物670 nm。计算底物IC50值和多药耐药逆转倍数。重复3次。

1.2.2体内实验 收集约1×107K562/adr细胞,皮下植入至5～6周裸鼠腋下。肿瘤直径达0.5 cm时随机分四组处理：生理盐水组(4 ml每2天1次灌胃,12 d)；Ceritinib组(25 mg/kg,每2天1次灌胃,共12 d)；阿霉素组(2 mg/kg,每2 天1次腹腔注射,共12 d)；Ceritinib联合阿霉素组(注射阿霉素前1 h给予Certinib灌胃,25 mg/kg,每2天1次；阿霉素2 mg/kg,每2天1次腹腔注射,共12 d)。每2天检测小鼠体重和肿瘤正交直径,绘制肿瘤生长曲线,计算生长抑制率。

1.3观察指标 分析Ceritinib对增强传统化疗药物的作用；比较四组肿瘤体积和肿瘤平均重量。

1.4统计学方法 采用SPSS22.0统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差 ()表示,采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1Ceritinib对增强传统化疗药物的作用分析Ceritinib能够浓度依赖性降低 K562/adr 细胞阿霉素和紫杉醇的IC50值,即增加其对细胞的毒性作用,但是Ceritinib却未能改变顺铂(不是ABCB1底物的)的细胞毒性。见表1。

表1 Ceritinib对增强传统化疗药物的作用分析()

表1 Ceritinib对增强传统化疗药物的作用分析()

2.2四组肿瘤体积和肿瘤平均重量的比较 生理盐水组、Ceritinib组、阿霉素组裸鼠的肿瘤体积比较差异无统计学意义(P>0.05)；Ceritinib联合阿霉素组的肿瘤体积小于生理盐水组、Ceritinib组、阿霉素组,差异有统计学意义(P<0.05)；Ceritinib联合阿霉素组肿瘤平均重量低于生理盐水组、Ceritinib组和阿霉素组,差异有统计学意义(P <0.05)。见图1,表2。

表2 四组肿瘤平均重量比较(,g)

表2 四组肿瘤平均重量比较(,g)

注：与生理盐水组、Ceritinib组和阿霉素组比较,aP<0.05

图1 四组肿瘤体积比较

3 讨论

白血病是目前发病机制尚不明确的恶性血液肿瘤,病程上主要分为急性和慢性两类［5］。治疗过程中产生的多药耐药是导致白血病治疗失败和复发的主要因素。多药耐药是指在通过一种抗肿瘤药物治疗后不仅出现了对该药的抵抗性,而且会对其他具有相似结构或相似靶点的药物也同时产生抵抗［6］。及时有效的发现肿瘤耐药的主要原因和机制,并找到更加有效的治疗办法或者克服耐药成为目前白血病治疗的关键。

Ceritinib是一种小分子酪氨酸激酶的选择性第二代ALK抑制剂,可以通过与抗癌药物竞争 ABCB1的底物结合位点,抑制ABCB1转运蛋白的外排活性,表明Ceritinib在表达ABCB1过表达的多药耐药实体肿瘤细胞中具有强效的逆转活性［7］。其作用机制是通过抑制ALK和ALK介导的下游信号蛋白的磷酸化,间接抑制ALK阳性癌细胞的增殖［8］。本研究结果显示,Ceritinib能够浓度依赖性地降低 K562/adr 细胞阿霉素和紫杉醇的IC50值,即增加其对细胞的毒性作用,但是Ceritinib却未能改变顺铂(不是ABCB1底物的)的细胞毒性。生理盐水组、Ceritinib组、阿霉素组裸鼠的肿瘤体积比较差异无统计学意义(P>0.05)；Ceritinib联合阿霉素组的肿瘤体积小于生理盐水组、Ceritinib组、阿霉素组,差异有统计学意义(P<0.05)；Ceritinib联合阿霉素组肿瘤平均重量低于生理盐水组、Ceritinib组和阿霉素组,差异有统计学意义(P<0.05)。国内研究［9］提示,Ceritinib能够在85%以上的细胞存活浓度下增强抗肿瘤药物的疗效,逆转ABCB1转运蛋白所介导的多药耐药,与本研究结果一致。

综上所述,Ceritinib可以增强ABCB1过表达白血病细胞化疗药物的疗效,为新型多药耐药调节剂的开发提供策略。