miR-147a在膀胱癌组织和细胞中的表达及对膀胱癌细胞增殖及细胞迁移的影响

张静，付强，高闫尧

空军军医大学第二附属医院检验科1、泌尿外科2，陕西 西安710038

膀胱癌是起源于膀胱的恶性肿瘤，好发于50岁以上的男性，发病与环境、吸烟、职业暴露等因素有关[1]。流行病学调查显示，2018年我国膀胱癌的发病率在各恶性肿瘤发病中位居16位，其中男性发病率是女性的3~4倍，并且呈现出逐年上升的趋势，年轻化趋势也较为明显[2]。手术治疗、药物治疗等均为膀胱癌的常见治疗手段[3]。近年来，有研究发现微小核糖核酸(miRNA)与恶性肿瘤细胞的发生、发展有着密切的联系，集中表现为对肿瘤细胞的增殖、侵袭能力影响，属于小分子RNA[4]。既往有报道指出，在结肠癌、乳腺癌等恶性肿瘤中，miR-147a可以作为肿瘤抑制因子实现对肿瘤进程的负性调控[5]。本研究旨在探究miR-147a在膀胱癌组织和细胞中的表达及对膀胱癌细胞增殖及细胞侵袭能力的影响，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取空军军医大学第二附属医院2017年1月至2020年3月间采集到的人体膀胱癌组织标本、癌旁正常组织标本30对进行分析。全部标本所对应的患者均被确诊为膀胱癌，且行根治性膀胱切除术手术治疗。术前所有患者均未接受放疗、化疗或者其它相关的药物治疗手段。全部标本中男性21例，女性9例；年龄35~78岁，平均(57.46±2.58)岁，其中＜40岁3例，40~59岁7例，≥60岁20例；确诊时病程2~8年，平均(4.65±0.38)年，其中4年以下16例，4年以上14例。本研究在患者知情情况下签署了同意书，所采集到的用于实验研究的组织标本，均经医院伦理委员会批准(科伦审[2016]56号)。

1.2 实验试剂DMEM培养液购自于Gibco公司，10%新生牛血清购自于Hyclon公司，β-actin和miR-147a一抗以及二抗购自于ATCC公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞转染实验 一组为miR-147a mimics组(转染miR-147a mimics序列)，另一组为miR NC组(转染miR NC序列)。观察um-uc-3细胞密度的生长情况，若在80%左右，则将mi R-147a mimics和miR NC序列分别转染进 um-uc-3细胞，此过程要求严格执行LipofectamineTM2000说明书步骤。

1.3.2 qRT-PCR检测法 提取各组细胞RNA，采用Trizol法进行提取，取0.2 g逆转录成cDNA，经qPCR仪进行扩增检测，严格执行PCR试剂盒要求以及相关引物要求。检测后，所获取的数据行2-ΔΔCt方法分析，分析和比较miR-147a表达量。

1.3.3 MTT实验 对um-uc-3细胞进行接种处理，所接种的场所为96孔板。接种时控制好接种的密度，尽可能地在5×104/mL左右。调整培养的条件：温度为37℃，培养箱含5%的CO2，培养时间为24 h、48 h、72 h、96 h。培养时，将10 μL MTT加入至每孔，培养4 h后，再将100 μL二甲基亚砜加入至每孔中。检测570 nm处的光密度(OD570)值(酶标仪)，反复检测3次，计算平均值作为最终数值。

1.3.4 划痕实验检测转染后膀胱癌细胞的迁移能力48 h，接种miR-147a mimics和miR-NC组膀胱癌5637和T24细胞于6孔板中，待细胞汇合到90%时用10 μL移液枪头沿垂直方向划痕，反复冲洗3次(PBS溶液)，于培养基(不含血清)中进行培养。24 h后，使用显微镜对细胞划痕间距进行观测，根据“(0 h划痕间距~24 h划痕间距)/0 h划痕间距×100%”这一公式计算细胞迁移率。

1.4 统计学方法 应用SPSS23.0统计软-件分析数据，计量资料符合正态分布，以均数±标准差(±s)表示，两两比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌和正常组织、细胞的miR-147a表达水平比较 膀胱癌组织的miR-147a表达为(0.37±0.06)%，正常膀胱组织的miR-147a为(1.20±0.15)%，膀胱癌组织明显低于正常膀胱组织，差异有统计学意义(t=5.256，P＜0.05)。 膀 胱 癌 细 胞miR-147a表 达 为(0.41±0.08)%，正常膀胱细胞miR-147a表达为(1.69±0.25)%，膀胱癌细胞明显低于正常膀胱细胞，差异有统计学意义(t=4.108，P＜0.05)。

2.2 miR-147a转染效率 如图1所示，miR-147a mimics组的miR-147a表达量上升，由此判定miR-147a成功整合并表达。

图1 miR-147a表达情况

2.3 miR-147a对膀胱癌细胞增殖的影响miR-147a mimics组在不同时间点OD值相对较低，转染后72 h、96 h，miR-147a mimics组OD值明显低于miR-NC组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 miR-147a对膀胱癌细胞增殖的影响(±s)

表1 miR-147a对膀胱癌细胞增殖的影响(±s)

组别OD值24 h48 h72 h96 h miR-147amimics组0.32±0.050.50±0.110.75±0.261.30±0.38 miR-NC组0.33±0.050.53±0.121.06±0.341.71±0.46 t值0.4470.5832.2902.173 P值0.6600.5670.0340.043

2.4 miR-147a对um-uc-3细胞迁移能力的影响miR-147a mimics组的细胞迁移能力明显低于miR-NC组，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图2和表2。

表2 miR-147a对um-uc-3细胞迁移能力的影响(±s)

表2 miR-147a对um-uc-3细胞迁移能力的影响(±s)

组别 细胞迁移数(株)细胞侵袭数(株)miR-147amimics组123.06±25.1691.48±16.74 miR-NC组314.75±68.52252.30±57.23 t值8.6209.256 P值0.0010.001

图2 膀胱癌细胞迁移能力(结晶紫染色×200)

3 讨论

膀胱癌是临床泌尿系统最为常见的恶性肿瘤之一，发病后多数可见无痛血尿，也有尿频、尿急、尿痛、排尿困难等症状，肿瘤侵袭或转移可累及系统相关症状[6]。数据调查显示，恶性肿瘤死亡中，膀胱癌致死约占3%[7]。至今，膀胱癌发病原因并不明确，但可以肯定的是多种因素作用产物，包括内在遗传因素、外在环境因素。根治性手术是治疗膀胱癌的常见术式，可有效将病灶切除，但从临床报道来看仍有一定的复发率和转移率，从而导致患者5年生存率偏低[8]。随着临床对膀胱研究的不断深入，遗传学逐渐成为了研究的重要方向。为此，本研究从遗传学的角度出发，深入了解膀胱癌的发病机制。

既有研究指出，非编码RNA在其中发挥着重要的调节作用[9-11]。另有研究表明，恶性肿瘤受到miRNA的调节，恶性肿瘤的调节，其机制表现为：靶向结合mRNA的3非编码区互补配对序列→调节RNA的表达量→引起下游生物学改变[12-14]。miR-147a是miRNA家族的重要一员，于2002年由Lagos Quin-tana团队从小鼠脾脏中克隆出来，定位在人类基因组9q33.2。研究发现，miR-147在慢性粒细胞白血病、结肠癌和乳腺癌中作为一个肿瘤抑制因子，能够负性调控肿瘤的进程[15]。目前，学界关于其在恶性肿瘤中的调控作用研究并不少见，尤其是在结肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等恶性肿瘤中，其表达会直接影响肿瘤的发展，同时在慢性粒细胞白血病中的低表达现象也同样存在[1-17]。目前，尽管在恶性肿瘤中，miR-147a的作用比较明确，但是对于膀胱癌患者而言并不清楚[18-19]。本研究结果显示，相较于癌旁正常组织、细胞的miR-147a表达水平，膀胱癌组织、细胞的miR-147a表达水平明显更低(P＜0.05)，说明了在膀胱癌的发生过程中，miR-147a扮演着抑癌的角色，而这也可能成为膀胱癌潜在的诊断分子靶点。为进一步揭示miR-147a对膀胱癌细胞增殖的影响，本研究采用MTT实验进行分析，结果显示对于膀胱癌患者而言，miR-147a的表达水平上升，可有效地抑制细胞的增殖能力，这与临床有关乳腺癌、结肠癌等恶性肿瘤中，miR-147a表达对于癌细胞增殖的抑制报道一致[20-21]，因此有较高的可信度。另外，本研究关于miR-147a对癌细胞迁移能力的影响分析，通过观察miR-147a对膀胱癌细胞迁移、侵袭能力的影响，结果显示miR-147a可明显一致um-uc-3细胞迁移能力。尽管本研究取得了上述研究成果，但是也存在一定的局限性，比如纳入研究的样本数量偏少，可能会对研究结果的科学性产生影响，因此在日后的研究中需不断加以改进。

综上所述，在膀胱癌组织、细胞中，miR-147a的表达呈现低表达，其参与了疾病的发生、发展过程，这可能成为膀胱癌诊断及治疗的潜在生物学新靶点，但其通过何种信号通路实现抑制仍有待进一步探究。