厚朴总酚对几种病原菌的抑菌作用

郭冰玉，左洋洋，王先科，李 莉

（1.河南师范大学水产学院，河南新乡 453007；2.河南省水产科学研究院，郑州 450044）

细菌性疾病是水产养殖中最常见、危害最大的一类疾病，随着高密度集约化养殖技术的推广，在养殖产量提高的同时，也导致了鱼病频发的现象。细菌性烂鳃病、细菌性肠炎、细菌性败血症、竖鳞病和赤皮病的暴发给水产养殖业者带来惨重的经济损失。抗生素是治疗细菌性疾病的常用药物，在水产养殖中常常由于长期不规范的使用，导致耐药菌的产生，水产品药物的残留以及水体环境污染和微生态平衡的破坏等问题[1]。近年来有关中草药在水产养殖中应用的相关研究表明，中草药含有的生物碱、有机酸、多糖等免疫活性成分，可以参与调节鱼类营养代谢，提高鱼类免疫力。且对水体不会产生污染，是具有开发应用潜力的替抗产品[2]。

厚朴(Magnolia officinal is Rehd.et.Wils.)为木兰科(Magnoliaceae)木兰属(Magnolia)植物厚朴或凹叶厚朴的干燥干皮、根皮、枝皮[2]。厚朴总酚是提取中药厚朴的酚类化合物，主要包括厚朴酚与和厚朴酚两种有效活性成分，在传统中医药学中主治人的食积气滞、腹胀便秘、湿阻中焦、痰壅气逆和脘痞吐泻等[3]。近年来的研究发现厚朴具有广谱抗菌作用，对葡萄球菌(Staphyl ococcussp.)、溶血性链球菌(Streptococcus hemolytic)、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)等革兰氏阳性菌以及炭疽杆菌(Baci llus anthraci)、痢疾杆菌(Shigell a Cast ellani)、伤寒杆菌 (Salmonella typhi)、副伤寒杆菌(Salmonella enterica)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、变形杆菌(proteus species)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)等革兰氏阴性菌均有抗菌作用，抗菌性能比较稳定[4]。

在厚朴提取物中酚类的抑菌效果较好，吴维萍(2008)在厚朴提取物对不同病原菌抑菌效果的研究中表明，厚朴提取物与厚朴酚对链球菌(St reptococcussp.)MIC分别为12.58μg/片、6.29μg/片[5]，林桂芸(2003)的研究表明和厚朴酚对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、Streptococcus的最小抑菌浓度 (minimal inhibitory concentration，MIC)均在l0 mg·L-1以内[6]。在已有的研究中，多以陆生动物致病菌为研究对象，而有关厚朴提取物对水生病原菌的研究鲜有报道。本试验选择水生病原嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophi la)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和陆生动物病原金黄色葡萄球菌为研究对象，使用倍比稀释法和平板点菌法测定了厚朴总酚对6种常见致病菌的MIC和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)。旨在为厚朴总酚用于水产动物细菌性疾病的科学防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验菌株

供试S.aureus、V.anguillarum、V.parahemolyticus、E.tarda、A.hydrophila和S.iniae均保存于河南师范大学水产学院水产动物医学团队。

1.1.2 供试药物及试剂

供试厚朴总酚纯度为98%，二甲亚砜（DMSO）、氯化钠和氢氧化钠等均为分析纯。

胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉购自上海生工生物工程有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 Luria-Bertani(LB)培养基的制备

LB液体培养基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化钠，使用2M NaOH溶液调pH至7.0～7.2，121℃高压灭菌后备用。

LB固体培养基：在LB液体培养基的基础上添加1.5%的琼脂粉，121℃高压灭菌，倒入培养皿待凝固后备用。

1.2.2 药物预溶及药物梯度的配制

根据厚朴总酚的溶解性，选择DMSO为溶剂。称取51.2 mg的粉状厚朴总酚提取物，溶于1 mL DMSO得到51.2 mg·mL-1的母液。使用LB液体培养基为稀释液，在试管中做二倍系列稀释，最终得到浓度分别为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg·mL-1的厚朴总酚的10个药物浓度梯度。

1.2.3 菌株活化

从-80℃取出6种待测菌株，用接种环分别蘸取少许在LB固体培养基上采用四区划线法进行划线，分别将S.aureus、V.anguillarum、V.parahemol yticus置于37℃，A.hydrophila、E.tarda置 于28℃，S.iniae于30℃恒温培养12～16 h，至培养皿中长出单菌落后备用。

1.2.4 菌悬液的制备

分别从固体培养基上挑取单菌落于1 mL LB液体培养基中，S.aureus、V.anguillarum、V.parahemolyticus37℃，E.tarda、A.hydrophila28℃，S.iniae30℃，200 rpm振荡培养6～8 h，之后以1∶100的比例按照以上培养条件进行扩大培养，培养至OD600nm为0.6左右备用。

1.2.5 最小抑菌浓度的测定

试验共分为10个浓度组，1个阴性对照和1个阳性对照，所有药物梯度和阳性对照重复三个平行。实验前将1.2.4的菌悬液做适当稀释，调整菌液浓度为106cfu·mL-1，试验组的每个EP管中加300μL稀释后的菌液之后，分别依次加入300μL 1.2.2中配置的10个浓度梯度的药物，每个菌种的每个药物梯度重复三个平行；阳性对照为300μL菌悬液和300μL LB液体培养基；阴性对照为600μL的LB液体培养基。6种细菌的培养条件同1.2.3，恒温培养18～24 h后进行观察，在所有无肉眼可见白色絮状物生长的澄清药物浓度中，浓度最小的药物梯度为该药物的MIC。

1.2.6 最小杀菌浓度的测定

取出1.2.5菌药混合物中MIC的前3～5个药物梯度，在先前准备的的LB固体培养基中分别点菌，每个药物梯度设置三个平行。将点过菌的LB固体培养基放入培养箱倒置培养。细菌培养条件同1.2.3培养18～24 h后进行观察，所有不长菌的药物梯度中最小浓度即为该药物的MBC。

2 结果

2.1 厚朴总酚对常见病原菌的抑菌活性

使用倍比稀释法检测厚朴总酚对A.hydrophila、E.tarda、V.parahemolyticus、V.anguillarum、S.aureus、S.iniae的敏感性，经过培养24 h后，6种病原菌在不同药物梯度中的生长情况详见表1。根据肉眼观察无白色絮状生长的澄清培养基中，浓度最小的药物梯度为厚朴总酚对某种细菌的MIC，厚朴总酚对S.iniae、S.aureus、V.anguillarum和V.parahemolyticus的MIC分别为16μg·mL-1、16μg·mL-1、32μg·mL-1和64μg·mL-1。而A.hydrophila和E.tarda的所有浓度梯度的EP管中均有白色絮状物质，说明厚朴总酚对这两种致病菌的MIC均 大 于512μg·mL-1。结 果 显 示S.aureus、V.anguillarum、V.parahemolyticus和S.iniae这四种菌株对厚朴总酚较为敏感，而A.hydrophi la和E.tarda对厚朴总酚不敏感。

表1 厚朴总酚对常见病原菌的抑菌作用

2.2 厚朴总酚对常见病原菌的杀菌活性

根据厚朴总酚对6种病原菌的MIC实验结果，选取S.aureus、V.anguillarum、V.parahemolyticus和S.iniae菌药混合物中MIC的前3～5个药物梯度，在LB固体培养基中分别点菌，培养24 h后，观察平板上菌落的生长情况，结果显示厚朴总酚对S.iniae、V.anguillarum、V.parahemolyticus和S.aureus均有不同程度的杀菌作用，MBC分别为32μg·mL－1、64μg·mL－1、128μg·mL－1和256μg·mL－1（表2）。由于A.hydrophila和E.tarda的最小抑菌浓度超过本实验设置的最高药物浓度，则MBC高于512μg·mL－1。

表2 厚朴总酚对6种病原菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

3 讨论

张云(2012)研究了厚朴酚对几种微生物的抑菌作用，结果显示厚朴酚对人类常见致病菌S.aureus和E.coli的MIC分别为10μg·mL－1和5μg·mL－1，对人畜－禽共患致病菌沙门氏杆菌(Salmonella.sp)的MIC为5 μg·mL－1，而对植物致病菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)的MIC分别为5 μg·mL－1和10μg·mL－1，对啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的MIC为10μg·mL－1[7]，说明厚朴酚具有广谱抗菌作用且抑菌效果明显。刘桂兰等(2018)对厚朴总酚对乳房炎致病菌S.aureus的抑菌作用及抗溶血作用的研究表明，厚朴总酚对S.aureus的MIC范围为8～16μg·mL－1[8]。而在本试验中，厚朴总酚对S.aureus的MIC为16μg·mL－1，结果与刘桂兰和张云(2012)的研究结果不完全相同，但差别微小，可能与菌株来源不同、试验方法不同有关。

梁利国(2010)研究了常用中草药对4种病原弧菌的体外抗菌效果，结果显示，五倍子(Rhus chinensis Mill.)、石榴皮(Granti pericarpium)、苏木(Caesalpiniasappan Li nn)和地锦草(Euphorbia humifusa Willd.)等对V.anguillarum、V.parahemolyticus、 河 口 弧 菌(V.aestuarianus)以及霍乱弧菌(V.cholerae)等均具有较好 的 抑 菌 和 杀 菌 效 果，MIC为0.78～6.25 mg·mL－1，MBC为3.12～12.5 mg·mL－1[9]，而本研究中厚朴总酚对V.anguill arum和V.parahemol yticus的MIC分别为32μg·mL－1和64μg·mL－1，MBC分别为64μg·mL－1和128μg·mL－1，结果显示厚朴总酚的对这两种弧菌的抑菌和杀菌效果比以上四种中草药更为显著。

本研究中厚朴总酚对A.hydrophila的MIC和MBC均大于512μg·mL－1，抑菌效果不明显。与吴家玉(2021)提出的厚朴酚对嗜水气单胞菌不具有抑菌或杀菌作用的观点一致。但是在饲料中添加厚朴总酚投喂异育银鲫(Carassius auratus gi belio)，却能够减少A.hydrophila感染引起的异育银鲫的死亡，与对照组相比，厚朴酚处理后的异育银鲫ALT、AST和LDH显著下调，TP和ALB含量显著上升(P＜0.05)，CAT、SOD活性显著提高，GSH含量显著提高(P＜0.05)，MDA显著下降(P＜0.05)，在一定程度上缓解肝脏和脾脏的充血，改善肾脏和肠道的细胞坏死，说明该药物可降低异育银鲫的组织氧化损伤。此外，厚朴酚还可显著下调MyD88、NF－κB和TNF－α基因的表达量，提高TLR－5基因表达量(P＜0.05)，表明该药物可通过下调机体炎症反应相关基因的表达来发挥抗炎功能[10]，因此厚朴酚对预防鱼类细菌感染以及在抗菌免疫中发挥重要作用，可作为一种免疫增强剂开发应用。

本研究结果显示，厚朴总酚对S.iniae的MIC(16 μg·mL－1)和MBC(32μg·mL－1)在供试菌株中均为最低，而厚朴总酚对S.aureus的MIC(16μg·mL－1)虽然也较低，但MBC(256μg·mL－1)却较高，推测厚朴总酚对不同种类细菌的作用机制不同，厚朴总酚对S.iniae主要发挥杀菌作用，而对S.aureus可能发挥抑菌作用。此外，厚朴总酚对淡水鱼致病菌A.hydrophila无明显抑菌作用，但相关研究中发现厚朴总酚对A.hydrophila引起的疾病有一定的缓解作用，因此在面对由A.hydrophila感染引起的疾病时，厚朴总酚可以辅助或替代传统化学合成药物参与治疗。

综上，厚朴总酚作为一种天然中草药提取物，在抑菌、杀菌以及抗炎方面发挥作用，可一定程度上替代抗生素和化学合成类药物在水产养殖中的使用，提高水产品的质量安全和改善养殖环境。本研究为后续厚朴总酚对水生致病菌感染水生动物后治疗效果的相关研究奠定了基础，为厚朴总酚用于水产动物细菌性疾病的科学防控提供理论依据。