黄河鲤figla基因表达分析

吕茜茜，冯世坤

（河南师范大学水产学院，河南新乡 453007）

卵泡是哺乳动物卵巢上的基本发育单位，早期卵巢上的卵泡基因调控开始于生殖细胞簇和原始卵泡的形成。原始卵泡可以不断生长，并发育为初级和次级卵泡。生殖系a因子（figla）是一个螺旋-环-螺旋碱性转录因子，在生殖细胞中特异性表达，是原始卵泡形成所必需的因子之一。在小鼠的雌性性腺中，figla最早表达于胚胎期的13.5 d，并参与后续卵泡与生殖细胞簇的发育过程[1]。figla的缺失会影响与减数分裂相关基因（Sycp5、Rad51、Ybx2）和与卵母细胞生长分化相关基因（Nobox、Lhx8、Taf4b）的表达，造成减数分裂的异常，损伤DNA并因此导致卵母细胞凋亡[2]。在缺乏figla的小鼠品系中，生殖细胞的迁移和增殖未受到影响，胚胎性腺发育正常，然而，在出生后卵母细胞会迅速凋亡，原始卵泡未能形成，最终导致雌鼠不孕[1]。

基于figla在哺乳类卵巢分化过程中的重要作用，水产科学工作者也展开了它在硬骨鱼类中的研究。在青鳉（Oryzias latipes）中，figla基因在成鱼卵巢中大量表达，但在成鱼精巢中不表达[3]。另外，在其他硬骨鱼类中也发现了figla在卵巢中大量表达的特征，例如大鳞海猪鱼（Halichoeres poecilopterus）、挪威鲑鱼（Atlantic salmon Salmo salar）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）、原雌濑鱼（protogynous wrasse Halichoeres trimaculatus）、日本鳗鲡（Japanese ell Anguilla japonica）等。在黑绸（Acanthopagrus schlegeli）的研究中发现，在雄性支持细胞向雌性滤泡细胞转化的过程中，figla作为关键控制因子，可能在黑绸的性逆转中有重要作用[4]。在尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）中，figla基因仅在卵巢表达，在其他组织不表达；在XY个体过表达figla基因导致精子发生异常，暗示Fig.a通过抑制雄性精子发生，而在卵巢发育中有重要作用[5]。在斑马鱼中研究发现，figla在早期斑马鱼卵巢发育中起着重要的作用，在由卵母细胞形成单个卵泡的过程中尤为重要[6]。

黄河鲤（Cyprinus carpio haematopterus），是我国重要的淡水鱼类，其雌鱼较雄鱼长得快。单性养殖可以提高产量，因而很有必要开展黄河鲤性别决定与分化分子机制研究。为了研究figla在黄河鲤卵巢分化过程中的作用，本实验从已公布的鲤鱼基因组数据中分离到figla序列，设计了ORF（Open reading frame）引物，以黄河鲤性腺为模板克隆了f igla基因的ORF序列，并通过同源性比对、系统进化分析等对其进行分析。通过RT-PCR实验来分析figla在黄河鲤雌、雄鱼不同组织，胚胎发育不同时期的表达情况，为后续figla基因功能研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料的收集

本实验所用黄河鲤均取自河南师范大学水产养殖基地，选取健康成鱼作为亲鱼进行培育。

在繁殖季节（每年4～6月份），挑选健康雌雄鱼进行人工催产、授精[7]，将得到胚胎在23±2℃，孵化过程中，定期取样观察胚胎发育情况，取不同发育时期（未受精、受精、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、尾芽期、心跳期、出膜期）胚胎材料，提取总RNA。凝胶电泳检测RNA完整性，ND-2000核酸蛋白仪测定其浓度及OD值。

1.2 黄河鲤fi gla基因ORF全长的克隆

根据NCBI上已公布鲤鱼基因组数据，分离figla序列，并设计ORF相关引物（表1），成鱼卵巢总RNA为模板，按照TaKaRa第一链cDNA合成试剂盒（RR047A）说明书操作，合成第一链cDNA，并用DNA酶去除基因组DNA，随后以其为模板进行PCR，扩增黄河鲤figla。PCR条件如下：94°C预变性3 min，94°C变性30 s，59°C退火30 s，72°C延伸1 min，循环35圈；72°C延伸10 min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并纯化，连接、转化，将阳性菌落进行测序。基于已获得的序列设计特异性引物（表1），使目的片段在400-600 bp左右，进行组织分布以及胚胎发育时期figla表达量检测。

表1 所用引物序列

1.3 黄河鲤f i g la基因氨基酸序列及系统进化分析

将测序所得黄河鲤figla基因ORF序列，使用MEG软件进行同源性比，利用在线网站（http://www.expasy.ch/tools/）推算其编码氨基酸序列情况。分子系统进化树用MEGA 6.0软件邻位相连法Neighbor-Joining（bootstrap values为1000）构建。

1.4 黄河鲤f i g la基因组织分布

选取健康成鱼取各组织（脑、心脏、肌肉、肝脏、脾、肠、性腺、肾脏等），并提取总RNA，按照TaKaRa第一链cDNA合成试剂盒（RR047A）说明书进行逆转录合成cDNA，并以其10倍稀释量作为RT-PCR模板。RT-PCR检测figla在各组织表达情况。反应体系（20μL）：rTaq酶0.3μL，buffer 2μL上、下游引物各0.5μL，cDNA模板2μL，ddH2O 14.7μL；反应程序：94°C预变性2 min；94℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，共28个 循 环；72℃10 min，4℃10 min。以β-actin为内参。

1.5 黄河鲤f i g la基因在不同胚胎期的表达

以各胚胎期总RNA为模板逆转录成第一链cDNA检测figla表达量。实验方法参照1.1和1.4。

2 结果

2.1 氨基酸序列比对

使用MegAlign软件对黄河鲤和其他物种的Figla氨基酸序列进行序列比对，发现与鲤科鱼类相似性较高，与其他物种同源性较低。黄河鲤Figla与金线鲃Figla相似性最高（96%），然后为斑马鱼（84.1%），最低的是人（24.2%）。与其他脊椎动物一样，黄河鲤Figla具有保守的bHLH结构域，但其它区域在不同物种之间的差异比较大（图1）。

图1 黄河鲤与其他脊椎动物的Figla氨基酸序列比对分析

黑色框框及划线所指区域为“bHLH”DNA结合结构域保守区域，用灰色或黑色标记

2.2 系统进化分析

利用MEGA 6.0构建系统进化树，黄河鲤Figla与其他硬骨鱼类聚为一枝，其中与鲤科鱼类具为一小支，这与其分类地位一致。

MEGA 6.0构建进化树，以黄河鲤Max为外类群

图2 脊椎动物Figla系统发生分析

2.3 组织分布

RT-PCR结果表明，figla在精巢及其他组织中均不表达，主要表达于卵巢（图3）。

图3 黄河鲤f igla在成体组织中的表达

2.4 不同胚胎期表达

以管家基因-actin作为参照基因，通过RT-PCR来检测figla基因在黄河鲤胚胎发育过程中的表达情况。结果发现，figla在未受精、受精及卵裂期存在表达，而后figla几乎不表达（图4），暗示f igla可能是一个母源因子。

图4 黄河鲤figla在胚胎中的表达

3 讨论

已有的研究表明，在脊椎动物中，性腺的性别决定是一个高度受控的发育过程。转录因子Sry和Sox9以及Rspo1/Wnt/β-actin信号分别作为拮抗途径，从胚胎未分化性腺的共同原基中驱动一系列分化发育后，形成卵巢或精巢。其中，雌、雄性通路的拮抗中占优势的一方决定哺乳动物性别分化的方向。在雄性中，位于Y染色体的雄性性别决定基因Sry（sex-determining region on Y chromosome），于交配后12.5 d开始表达，并激活下游的特异基因Sox9和Fgf9，这些特异基因进一步诱导精巢的分化。而在雌性中，卵巢的分化方向则由既彼此独立，又具有协同作用的Rspo1/Wnt/β-actin通路以及Fox12激活的雌激素合成通路决定着。在哺乳类，卵巢的分化和维持需要生殖细胞和体细胞的相互作用，在这种cross-talk过程中，生殖细胞f igla发挥重要作用[8]。在无脊椎动物向高等脊椎动物进化过程中，鱼类处于进化的初始阶段，其中硬骨鱼物种数量占整个脊椎动物物种数量的一半。已有研究表明，在硬骨鱼中，figla也是一个卵母细胞特定的标记因子[9]。

通过分离黄河鲤figla基因全长ORF序列，并进行Figla氨基酸序列比对后发现，黄河鲤Fig.a和其他物种的同源性较低。黄河鲤f igla的系进化分析中，与其他硬骨鱼类聚为一枝，这与其分类地位相一致。与此同时，RT-PCR分析表明，黄河鲤figla在卵巢中大量表达，而在精巢等组织中均不表达，这种表达模式跟在小鼠，人类，斑马鱼，青鳉和牙鲆（Paralichthys olivaceus）中的figla的表达模式基本一致。

有报道表明在胚胎发育母源mRNA被逐步降解的同时，合子基因组激活并开始转录，如在小鼠中，母源mRNA的大量降解，以及合子基因的表达开始于受精后22 h左右和第一次细胞分裂结束时；而在斑马鱼中，这个过程发生在受精后2.75 h和第10次细胞分裂时[10]。通过对黄河鲤胚胎发育过程中figla的表达情况的研究，发现在未受精、受精及卵裂期三个时期均存在表达，而后figla几乎不存在表达，暗示黄河鲤f igla可能是一个母源性因子。

综上，本研究通过对黄河鲤Figla氨基酸序列分析、系统进化分析以及在雌雄鱼不同组织、不同胚胎期表达的研究为进一步揭示figla在黄河鲤卵巢发育中功能奠定基础。