自微乳化给药系统促进卤泛群经淋巴转运的研究

谭亚男，尹宗宁

（1. 四川省食品检验研究院，四川 成都 611731；2. 四川大学华西药学院 靶向药物与释药系统教育部重点实验室，四川 成都 610041）

卤泛群[1-2]（halofantrine，HF）是菲甲醇的衍生物，分子式为C26H30Cl2F3NO，1988年5月在法国首次获准上市，主要用于治疗恶性疟和间日疟。已上市口服制剂一般为卤泛群的盐酸盐，水溶性差，生物利用度低，属于生物药剂学分类（BCS）中第II类药物，其次卤泛群的lgP值为8.716，脂溶性良好，符合自微乳给药系统（self-microemulsifying drug delivery system，SMEDDS）模型药物的要求。

SMEDDS是由表面活性剂、助表面活性剂、油相形成的固体或液体载药体系[3-4]。主要优点在于：将药物分散在微米级别的乳滴中，提高药物溶解度和溶出速率，促进药物吸收，减少最低给药量，降低副作用；不改变药物的分子形态，保持原有构型，避免了可能出现的晶型改变；药物被包裹在O/W型微乳内相的油相中，避免与水相接触，增强药物的稳定性。自微乳的辅料也能间接起到抑制胃肠道酶代谢及药物外排的作用，如吐温-80具有抑制P-糖蛋白（P-gp）外排的作用[5]。本研究以清醒的二插管大鼠为动物模型，建立了高效液相色谱（HPLC）检测淋巴中HF的方法，测定不同比例处方的生物利用度，以为HF口服制剂的开发提供研究思路与基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1100型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司） ；Nicomp 380 ZLS Zeta电位/粒度分析仪（美国PSS粒度仪公司）；QT-1旋涡混合器（上海琪特分析仪器有限公司）。

1.2 试药

盐酸卤泛群（HFT，武汉恩宇生物科技有限公司）；亚油酸乙酯（江苏奥奇海洋生物有限公司）；非诺贝特（FB，徐州恩华药业股份有限公司）；辛伐他汀（SV，上海市食品药品检验所）；花生油（美国Sigma-Aldrich公司）；吐温80（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（HPLC级，美国Tedia公司）；乙腈（HPLC级，美国Tedia公司）；其余试剂均为分析纯。

1.3 动物

SPF级SD大鼠，雄性（体重280～320 g），购自上海斯莱克实验动物有限公司。

2 方法与结果

2.1 卤泛群（HF）的制备

称取约2 g HFT，依次加入100 ml无水乙醇，0.25 g氢氧化钠，100 ml水及50 ml二氯甲烷，振摇2 min后静置分层，收集下层液体。上层液体再用25 ml二氯甲烷萃取一次，合并两次萃取得到的下层溶液。加入过量无水硫酸镁干燥，放置过夜。溶液经滤纸过滤后旋蒸至干，瓶中油状物即为HF。

2.2 卤泛群自微乳化给药系统（HF-SMEDDS）的制备

根据文献[6-7]和前期研究基础，选择亚油酸乙酯为油相，吐温80为乳化剂，无水乙醇为助乳化剂，制备HF-SMEDDS。由于HF较黏稠称量不便，可将HF定量加入吐温80中，超声溶解，得到便于称量和计算的含药吐温80。依次称取相应重量的亚油酸乙酯、乙醇和吐温80（由含药吐温80和空白吐温80两部分组成，含药吐温80质量相同，根据处方不同，称取相应空白吐温80）。涡旋混合均匀后，得到淡黄色澄清油状液体，即得HF-SMEDDS，避光密封备用。

2.3 HF-SMEDDS处方设计

为考察油相和混合乳化剂（吐温80和无水乙醇）的比例（A）及乳化剂与助乳化剂的比例（B）对HF淋巴转运的影响，依据星点设计原则[8]，设计了B值为1:1～2:1，A值为2/8（0.25）～4/6（0.667），极值为3:7的9个处方。表1为二因素的星点设计因素及水平表。按星点设计效应面优化得到9个处方，具体成分组成见表 2。

表1 因素及水平

2.4 HF-SMEDDS处方粒径测定

吸取HF-SMEDDS样品10 μl于离心管中，加入1～5 ml不等的超纯水使其自微乳化，用NICOMP 380 ZLS Zeta电位/粒度分析仪测定粒径，结果见表2。

表2 处方设计及制得HF-SMEDDS粒径

2.5 HF-SMEDDS中HF含量测定

精确称取HF-SMEDDS 0.1 g，按中国药典2020年版溶出度测定中第三法小杯法[9]的有关操作说明，将HF-SMEDDS装入普通胶囊中，每个处方平行操作3次，考察其体外释药情况。取样时间点分别为5，10，15，30，45 min。样品加入过量甲醇破乳，采用HPLC测定HF含量。色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，3.5 μm），加Alltech 充填式预柱（1.0 mm×20 mm）；流动相为乙腈-水（含 0.2 %十二烷基硫酸钠和0.2 %冰醋酸）（80:20）；检测波长：258 nm；柱温：40 ℃；流速：1.0 ml/min；进样量：20 μl。该条件下，HF的线性回归方程为A=1.4950C-0.2124，r=0.9972，在25～5000 ng/ml范围内线性关系良好。低、中、高3个浓度（1，25，100 μg/ml）的平均回收率分别为93.00 %，98.24 %，97.32 %，精密度RSD分别为2.60 %，1.88 %，2.89 %（n=3），符合样品分析要求。

2.6 清醒二插管大鼠模型的建立

2.6.1 颈静脉插管[10]SD大鼠经腹腔注射2 %戊巴比妥钠溶液（0.24 ml/100 g）麻醉，剃去颈部毛发，剪开约2 cm皮肤，依次钝性分离肌肉和脂肪组织，分离颈静脉，将两根手术线穿过血管，先结扎远心端处血管，防止血液回流，再将血管近心端手术线打一活结，在两根手术线间的血管段剪小口，插入静脉管至右心房时，系上近心端预留的活结，固定插管。注入生理盐水，将插管内残余的血液推回心房，防止血液凝固。在大鼠颈后皮肤开口，插入引导管，经皮至锁骨处与静脉插管联结。

2.6.2 淋巴插管[11]术前30 min，大鼠灌胃花生油2 ml，使淋巴管充盈，淋巴液由透明变为乳白色。麻醉大鼠后，剃去腹部体毛，剪开腹部淋巴总管对应处皮肤。用手术镊穿引形成皮下通道，将淋巴插管通过2.6.1项所述大鼠颈后皮肤开口经皮下至腹部皮肤开口，可使淋巴插管埋入大鼠皮肤固定，继续剪开腹部肌肉，挪动内脏，暴露乳白色肠系膜淋巴总管。在淋巴总管上剪开小口，插入淋巴插管，在剪口处用医用生物胶封闭并固定，缝合伤口，淋巴插管尾端部分插入大鼠背负的玻璃小瓶中，收集淋巴液。

2.6.3 术后护理 将淋巴插管与颈静脉插管连接，淋巴液可通过颈静脉重新进入体液循环。大鼠清醒后可恢复行动能力，主动饮水、进食。

2.7 给药方案及生物样品的采集处理

2.7.1 动物分组及给药 随机选取成功建模后的大鼠30只，每个处方组3只，作为受试组，分别灌胃给予表2中9组处方HF-SMEDDS 0.2 g（含HF 4 mg）。给药后1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，24，30 h通过颈静脉插管抽取0.3 ml血液，加入肝素钠作为抗凝剂，5000 r/min 离心10 min，取血浆待检测。同时间点收集大鼠背部玻璃小瓶内所有的淋巴液，加入适量抗凝剂混匀，作为淋巴样品待检测。3只作为参比组，通过颈静脉插管给予含HF脂肪乳（将HF加入20 ml脂肪乳注射液）0.3 ml。参比组给药后5，10，20，60 min及2，4，6，8，10，24，30 h通过颈静脉插管抽取血样。

2.7.2 淋巴样品预处理及方法学考察 取淋巴液100 μl，置入10 ml离心管中，加入内标50 μl，乙腈5 ml，涡旋10 min，静置，12 000 r/min离心10 min，取上清20 μl，按2.5项下色谱条件进样分析。HF的淋巴样品线性回归方程为：A=0.0187C+0.0014，r=0.9999，在2～250 μg/ml范围内线性关系良好。方法的定量限为25 ng/ml，检测限为10 ng/ml。方法回收率>98 %，日内、日间精密度（n=3）RSD分别为2.05 %，2.31 %，符合要求。

2.7.3 淋巴转运结果 按2.7.2项下方法处理淋巴样品，根据测得的HF浓度，结合相应时间段收集的淋巴液量，计算得到HF淋巴转运累积量占口服给药量的百分比值，结果见图1。各处方HF的淋巴转运基本在12 h内完成。处方8转运比例最高（19.64 %），处方1最低（2.25 %）。

图1 各处方淋巴转运累积百分比

2.7.4 血液样品预处理及方法学考察 取血液样品100 μl，加入内标辛伐他丁（40 μg/ml）溶液100 μl及乙腈100 μl，涡旋2 min混匀，12 000 r/min离心10 min。取上层清液转移至C8固相萃取小柱进行分离提取。萃取小柱预先用2 ml甲醇，2 ml去离子水活化。上清过柱后用1 ml去离子水洗涤2次，再用0.75 ml 15 %甲醇水（v/v）洗涤2次。最后用1 ml 乙醚洗脱两次，收集洗脱液。40 ℃氮吹至近干，100 μl乙腈复溶，涡旋2 min，12 000 r/min离心10 min，取上清20 μl进样检测。血液样品线性回归方程为：A=1.059C-113.72，r=0.9968，在31.25～2000 ng/ml范围内线性关系良好。该方法的定量限为25 ng/ml，检测限为10 ng/ml。方法回收率>90 %，日内、日间精密度RSD（n=3）分别为1.61 %，2.99 %，符合要求。

2.7.5 各处方HF血液转运结果及绝对生物利用度 按2.7.4 项下方法，测定9组处方口服给药后不同时间点血液样品中HF的浓度，得到HF血液转运量见图2，其中处方2血样中未检测到药物。

图2 各处方口服给药后药时曲线

按2.7.4项下方法，测定参比组血样中HF的含量，得到HF静脉给药不同时间点的药时曲线，见图 3。以参比组静脉给药量为对照，计算不同处方口服给药后的血液中药物含量与总给药量的比值，结果见表4。处方2血药浓度最低，未达到检出浓度。处方7血液中药物量与总给药量比值最高（13.13 %），其次为处方6（12.67 %）。

图3 静脉给药药时曲线

表4 口服给药后血液中药物含量与总药量的比值

3 讨论

SMEDDS能增加高脂溶性药物的溶解度，口服后迅速乳化分散，有效提高药物的吸收速率，同时通过增加药物的淋巴转运吸收提高药物的生物利用度。本研究中采用二插管动物模型进行药动学实验，分别测定淋巴液和血液中的药物含量，可直观地比较不同处方口服给药后淋巴转运的差异及生物利用度的不同。

动物模型的建立和生物样品的净化是实验的主要难点。已报道的二插管建模动物包括猪、狗、羊、大鼠等。动物体型越小，动物经费成本越低，但手术操作难度随之增加。本研究中采用清醒的SD大鼠做为实验模型，该模型术后恢复时间短，不影响动物的自主饮食活动，相较麻醉动物模型，实验数据更贴近正常动物口服给药后的药物代谢情况。实验周期内通过颈静脉插管和肠系膜淋巴插管，可随时方便地收集血样和淋巴液样品。但由于动物存在的个体差异和术后的恢复情况不同，所得药动学数据虽然可反映不同处方间的差异，但平行性较差，后续研究可通过增加实验个体数量改善这一问题。

通过肠系膜插管收集的淋巴样品，呈乳糜状，含大量的脂肪和蛋白质，杂质较少，乙腈提取操作中需注意涡旋提取的时间，我们比较了1，3，5，10 min不同时间的提取效率，发现涡旋10 min可提取完全。

血液样品药物浓度低，杂质多。根据药物的lgP值大小选择了C8固相萃取小柱，能有效完成对药物的富集和提取。

9组处方粒径范围从20～336 nm不等，包含了微乳剂和乳剂。粒径最小的微乳剂淋巴转运量最高，粒径最大的微乳剂淋巴转运量相对较低，但并非最低。分析实验结果，可发现微乳剂粒径大小与药物淋巴转运量有一定的联系。可能和药物吸收时酶解过程有关，粒径小的相对更易被酶解成脂肪酸和甘油单酯，更易于淋巴吸收。但仅从粒径大小无法完全预测淋巴转运量的高低。这表明还有其他因素共同影响药物淋巴吸收的环节，或者粒径的影响作用只在一定的范围内表现明显。

脂溶性药物经淋巴转运是其口服吸收的重要途径，本研究中微乳制剂处方的淋巴转运药物累积量最高可达给药剂量的19.6 %，对比最少的淋巴转运累积量只有2.2 %，说明通过改进制剂处方增加HF的淋巴转运量可有效提高药物生物利用度，为HF口服制剂研发提供了一定研究思路与基础。