超高效液相色谱串联质谱法测定中成药中马兜铃酸Ⅰ含量*

周春玲，刘天竹，李晓欣，康 强，李成森，赫爱平

（辽宁省检验检测认证中心·辽宁省药品检验检测院，辽宁 沈阳 110036）

马兜铃科Aristolochiaceae 马兜铃属Aristolochia L.植物具有广泛的药用价值，其所含的马兜铃酸类成分具有抗感染、抗肿瘤活性及增强吞噬细胞活性的作用。20 世纪80 年代起，有研究发现，马兜铃酸具有很强的肾毒性和致基因突变作用[1－4]。欧洲发现了因服用含马兜铃酸中药致肾衰竭的病例，美英等国先后禁止使用含马兜铃酸的原料和制品，原国家食品药品监督管理总局先后取消了青木香、广防己和关木通的标准，并要求对含马兜铃的中药制剂严格按处方药管理。我国马兜铃科植物有46 种，处方中含马兜铃属药材的中成药口服制剂有43 种，虽然许多研究中都测定了中药材中马兜铃酸的含量，但目前尚无关于含马兜铃植物的中成药的报道，现行中成药标准均无控制马兜铃酸含量的标准。马兜铃酸Ⅰ为马兜铃酸类化合物的主要毒性成分[5－10]，目前对于马兜铃酸类化合物的测定主要采用高效液相色谱（HPLC）法[11－15]。由于中成药所含药味较多，成分复杂，且马兜铃酸Ⅰ的含量较低，故本研究中采用超高效液相色谱串联质谱法测定中成药中马兜铃酸Ⅰ的含量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Acquity 型超高效液相色谱仪、Xevo TQ－S 型质谱仪（美国Waters 公司）；Auto Science 10200AD 型超声波清洗机（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；BSA 224SCW 型电子天平（德国Sartorius 公司）。

1.2 试药

13 种58 批样品（市售）；马兜铃酸Ⅰ对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110746－201611，含量为98.9%）；乙腈、甲酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 试验条件

2.1.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：0.1%甲酸（含10 mmol／L 甲酸铵，A）－乙腈（B），梯度洗脱（0 ～4 min 时50%A，4 ～7 min 时10%A，7 ～10 min 时50%A）；流速：0.3 mL／ min；柱温：25 ℃；进样量：1.0 μL。

2.1.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子模式；干燥气：氮气；毛细管电压：3.2 kV；氮气流速：800 L／h；离子源温度：150 ℃；干燥气温度：550 ℃；多反应离子监测（MRM）模式：母离子m／ z 359.2，子离子m／ z 296.0（定量离子）、m／ z 324.0；碰撞电压：18，20 V；区带电压：30，30 V。

2.2 溶液制备

取马兜铃酸Ⅰ对照品适量，精密称定，用70%甲醇制成质量浓度为0.1 mg／mL 的对照品溶液。取装量差异项下供试品，粉碎成细粉，取适量，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声（功率为250 W，频率为33 kHz）处理30 min，放冷至室温，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。分别按制剂处方和工艺制备缺木香、马兜铃、寻骨风、天仙藤、朱砂莲、细辛的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2 项下对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各适量，按2.1 项下条件进样测定，记录色谱图及质谱图，详见图1、图2。结果阴性对照品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应保留时间处无干扰峰，表明专属性良好。

图1 离子流色谱图Fig.1 Ion flow chromatograms

图2 马兜铃酸Ⅰ的质谱图和结构式图Fig.2 The mass spectrum and chemical structures of aristolochic acid Ⅰ

线性关系考察：分别精密量取2.2 项下对照品溶液，用70% 甲醇溶液稀释成质量浓度为0.046 55，0.232 80，0.931 00，4.655 00，9.310 00 μg／mL 的系列对照品溶液。按2.1 项下条件进样测定，记录峰面积。以马兜铃酸Ⅰ质量浓度（X，μg／mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y ＝13 222 X ＋55.6，R2＝0.999 9( n ＝5）。结果表明，马兜铃酸Ⅰ质量浓度在0.046 55 ～9.310 00 μg／mL 范围内与峰面积线性关系良好。

定量限与检测限考察：分别精密量取2.2 项下对照品溶液适量，倍比稀释，并按2.1 项下条件进样测定，以信噪比( S／ N)10 ∶1 和3 ∶1 分别计算定量限、检测限。结果定量限、检测限分别为0.05 ng 和0.015 ng。

精密度试验：取2.2 项下对照品溶液适量，按2.1 项下条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果的RSD 为1.60%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2 项下供试品溶液适量，分别于室温放置0，2，4，8，12 h 时按2.1 项下条件进样测定，记录峰面积。结果的RSD 为1.30%（n ＝5），表明供试品溶液在室温放置12 h 内基本稳定。

重复性试验：精密称取同一批样品适量，各6 份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.1 项下条件进样测定，记录峰面积。结果的RSD 为1.90%（n ＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品适量，共6 份，分别加入一定质量浓度的马兜铃酸Ⅰ对照品溶液，按2.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.1 项下条件进样测定，记录峰面积，并计算回收率。结果见表1。

表1 马兜铃酸Ⅰ加样回收试验结果（n ＝6）Tab.1 Results of the recovery test of aristolochic acid Ⅰ（n ＝6）

2.4 样品含量测定

取58 批样品各适量，分别按2.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.1 项下条件进样测定，平行测定3 次，记录峰面积，并计算样品含量。结果见表2。

表2 样品中马兜铃酸Ⅰ的含量测定结果（μg／g，n ＝3）Tab.2 Determination results of aristolochic acid Ⅰin the samples（μg／g，n ＝3）

3 讨论

本研究中检测的13 种中成药中马兜铃酸Ⅰ的含量差异较大，主要原因是中药材的来源不同，每种中药材中马兜铃酸Ⅰ的含量差异较大。另外，在国家允许的情况下，有些药材可替代使用，但使用过程中须注意交叉混淆、同物异名、同名异物等现象。为了保证用药安全，应注意做好对含马兜铃酸的药材和替代品应用的考察。

按欧盟标准，选择1 个母离子和2 个子离子，并依据子离子丰度比和化合物保留时间对马兜铃酸Ⅰ进行定性分析。质谱中常选用的母离子有[M ＋H]＋，[M ＋NH4]＋，[M－H]－等。以直接进样的方式考察马兜铃酸Ⅰ的质谱行为，结果母离子[M ＋NH4] ＋在被打碎后进入二级质谱形成的子离子稳定性较好。马兜铃酸Ⅰ母离子合理丢失后形成响应较高的子离子分别为 m／ z 296[M1＋H－NO2]＋，m／ z 324[M1＋H－H2O]＋。利用MRM模式对选定的定性碎片离子进行离子传输电压、碰撞电压、倍增电压等参数优化，最终筛选出m／ z 359.2→296.0 为定量离子对，m／ z 359.2→324.0 为定性离子对。按各个品种的处方和工艺制成阴性对照品，并加入适量的马兜铃酸Ⅰ对照品，制成供试品溶液，测定各品种的方法检测限。同时，按处方和工艺制成阳性样品作为质控样品，以提高测定的准确性。

综上所述，所建立的方法专属性强，快速、灵敏，可用于中成药中马兜铃酸Ⅰ的质量控制。