新会青柑茶与橘皮普洱茶的风味差异分析

江津津，贾强，谢佩桦，董蕾，陈烽华，任芳

（1.广州城市职业学院食品科学与美食养生学院，广东广州 510405）（2.海能科学仪器有限公司，山东德州 251500）

青柑茶是用广东新会茶枝柑的未成熟柑果的柑皮和云南普洱为原料经特殊工艺加工而成，将柑果内里的果肉掏空，果皮清洗晒干，将云南出产的普洱熟散茶装入柑皮内再进行干燥，采用阳光生晒或低温烘培或烘晒结合的方式以最大程度保留柑的内涵物质及其活性，从而为其陈皮香气奠定基础，且兼有茶和陈皮的功效。由于生理未成熟的柑果果皮颜色为青绿色，故而称之为青柑，按柑果的粒径由小到大，分为胎柑、小青柑、青柑。不同生长期的茶枝柑制成的青柑茶，风味和功效都不同。胎柑属于新会茶枝柑的胎果，是自然掉落的幼果或果农为了柑的品质而梳理出的不超过桂圆大小的柑果经过干燥后制得，胎柑几乎无果肉也不加普洱但是含丰富的挥发油，可以入药也可以直接冲泡，中医认为有疏肝破气，消积化滞、消炎的功效。新会茶枝柑的柑皮是制作陈皮的正宗原料，新会陈皮根据采收加工时间可分为柑青皮（青皮）、微红皮（黄皮）和大红皮（红皮）。青皮通常指立秋至寒露这段时间采收的茶枝柑的果皮，色泽呈青褐色至青黑色，质硬皮薄，味辛苦、气芳香。有文献报道，青柑皮的油酮类化合物含量丰富，挥发性芳香精油较多，冲泡时香气显著且更为耐泡，属于柑普茶中特点鲜明，香气浓郁的品类[1]。

新会青柑茶入肝胆经，可以健脾燥湿、疏肝润肺、消积化滞，也只有广东新会茶枝柑的柑皮和普洱制得的柑普茶才是陈皮普洱正品，至于其他各类柑皮、橘皮甚至橙皮则因产地不同而被统称为“橘皮”或者“杂果皮”，橘皮在药效上或各有所宜或功效较差。橘皮普洱指“橘皮”和普洱以与柑普茶相同的工艺加工而成的橘普茶。普洱茶有降血脂、降血糖、防癌、抗突变等功能，儿茶素、茶多糖、茶色素等是普洱茶中具有药理作用的主要成分[2]。儿茶素具有延缓衰老、抗氧化、降血糖、抑菌抗病毒、抑制动脉粥样硬化等作用[3]。茶褐素作为普洱茶中最主要的色素成分，含有多酚类、没食子酸、多糖、蛋白质、氨基酸等物质，是普洱茶品质组成的重要因素[4,5]。青柑茶和橘皮普洱的原料种属不同，导致两类产品的营养成分和风味有较大差异，其风味的差异可以采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用（HS-SPME-GC-MS）、顶空-气相离子迁移谱（HS-GC-IMS）来综合评价，结合感官量化描述分析（QDA）和相对气味活度值（ROVA值）进行研究[6]，也可以从游离氨基酸含量、茶色素、儿茶素、多糖等含量的差异进行探究[7]。

柑普茶是近几年来受到大众追捧的网红产品，但市面上也有不少橘皮普洱产品。关于新会青柑茶的风味研究不多且片面，通过对青柑茶和橘皮普洱的营养成分和风味的差异研究，可以探究青柑茶品质的奥妙并为柑普茶的质量调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料

用于分析测试的新会青柑茶分别为广东新会区三江镇产的胎柑（cpt1）、小青柑（cpt2，颗粒直径约30 mm）和青柑（cpt3，颗粒直径约50 mm）（均由企业提供）。与和青柑茶相同的干燥工艺自制橘皮普洱，样品cpt4配料为同仁堂橘皮和熟普散茶（企业提供），样品cpt5配料为亳州橘皮和熟普散茶（企业提供）。色谱用标准品及试剂均购自中国计量科学研究院化学所（国家标准物质研究中心），其他试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器设备

FlavourSpec®风味分析仪，德国Gas山东济南海能仪器股份有限公司；Agilent 7890N-5977气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦科技有限公司；SYKAM S-433D型氨基酸分析仪，德国 SYKAM 公司；WFZ-26A紫外可见分光光度计，天津市拓普仪器有限公司；TG16台式高速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；CU-600电热恒温水槽，上海精密仪器仪表有限公司；Waters高效液相色谱仪，沃特世科技（上海）有限公司；DU-20电热恒温油浴锅，上海精密仪器仪表有限公司；GM-1.0A真空泵，上海书培实验备有限公司；DGG-9620A电热鼓风恒温箱，上海览浩仪器设备有限公司；XT-NS1全自动氮吹浓缩仪，上海新拓分析仪器科技有限公司；Vortex-Genie2T漩涡混合器，北京开源国创科技有限公司；3NH310便携式色差计，深圳3nh科技有限公司、JA1003电子分析天平，上海精密仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 儿茶素的检测

样品粉碎并充分混合均匀，称取1.00 g中加入100 mL的100 ℃沸水，得到茶汤。根据Han等人的方法稍作改进[8]，从茶汤中提取儿茶素并进行定量分析，数据采用单因素方差分析进行统计学分析（t检验，p<0.05）。

1.3.2 茶氨酸与游离氨基酸的检测

将茶氨酸的标准储备溶液（0.00、0.10、0.20、0.50、1.00、1.50和2.00 mL）转移至10 mL容量瓶并定容摇匀，形成已知浓度为0.00、0.01、0.02、0.05、0.10、0.15和0.20 mg/mL的标准工作溶液。在粉碎的茶样1.00 g中加入100 mL沸水，100 ℃的电热油浴中30 min，趁热过滤，冷却后定容至100 mL，通过0.45 μm水相滤膜（φ13 mm×0.45 μm，上海计算技术研究所）。茶氨酸的检测依据国标GB/T 23193-2017，色谱条件：使用RP-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）的高效液相色谱仪（2489紫外/可见检测器）；检测波长为210 nm。等效洗脱条件为：三氟乙酸水溶液，pH 3.0，流速1 mL/min，柱温35 ℃，进样量10 μL，以保留时间定性，以茶氨酸标准曲线定量[9]。从茶叶中提取游离氨基酸，并根据Das等人的方法[10]定量。色谱柱：LCA K07/Li；流动相：柠檬酸锂A=pH 2.90；B=pH 4.20；C=pH 8.00，流速：洗脱泵0.45 mL/min+衍生泵0.25 mL/min；检测：570 nm+440 nm；温度：38 ℃~74 ℃梯度升温。

1.3.3 多糖的检测

样品粉碎并充分混合均匀，称取1.00 g加入100 mL的100 ℃沸水，得到茶汤。多糖从茶汤中提取后，按高效液相色谱法检测总多糖含量[11]。

1.3.4 茶色素的检测

茶黄素（TF）和茶红素（TR）的检测采用Owour法和Huang的方法[12,13]。称取3.00 g茶，放入250 mL烧瓶，加入125.00 mL沸水，沸水浴提取10 min，过滤冷却后取出 30.00 mL放入分液漏斗，然后放入30.00mL乙酸乙酯，振摇5 min，静置分层后取出15.00 mL乙酸乙酯，放入30 mL分液漏斗，加入15 mL 2.5%NaHCO3溶液，强烈震荡30 s。用95%乙醇定容于25 mL容量瓶中，得溶液a，用紫外分光光度计在380 nm处以95%乙醇为参比，测定溶液a吸光度（ODa）。吸取乙酸乙酯萃取液15 mL，加入2.5% NaHCO3溶液15 mL，在50 mL分液漏斗中迅速强烈振荡30 s，静置分层后，弃去NaHCO3水层。吸取乙酸乙酯上层液4 mL，放入25 mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度得c液（TFs）。吸取第一次水层待用液2 mL，放入25 mL容量瓶中，加入2 mL饱和草酸溶液和6 mL水，并用95%乙醇定容至刻度得d液（TRSⅡ+TBs）。分别吸取25 mL供试液和25 mL正丁醇放入100 mL分液漏斗中，摇振 3 min，待分层后将水层（下层）放于50 mL三角瓶中，取水层液2 mL于25 mL容量瓶中，分别加2 mL饱和草酸溶液和6 mL蒸馏水，再用95%乙醇定容至刻度，得b溶液（TBs）。用1 cm比色皿，以95%乙醇作空白参比，在380 nm波长处分别测定各溶液的吸光度A。茶褐素（TB）的测定方法[14]：称取5.00 g样品，加入125 mL沸水，100 ℃水浴中提取60 min。用脱脂棉过滤，在250 mL容量瓶中冷却并定容。将3 mL提取液转移到试管中，然后加入9 mL水并摇匀。采用系统分析法[14]测定茶褐素的含量，以蒸馏水为参比，用色差计测定ΔE*值，表征茶褐素的浓度。每个样品平行测量三次。根据以下公式计算TF、TB和TR的含量：

式中，m为试样质量（g）；w为试样干物质含量（%）；Aa为溶液a的吸光度；Ab为溶液b的吸光度；Ac为溶液c的吸光度；Ad为溶液d的吸光度，2.25和7.06均为在同等操作条件下的换算系数。

1.3.5 感官量化描述（QDA）分析

按照评茶的国标方法，称取3.00 g茶放入审茶杯，冲入沸水约150 mL，加盖静置5 min后，将茶汤倒入审茶碗，供感官品评，茶渣仍留于杯中供审查[15]。参考岳翠男等的方法对青柑茶和橘皮普洱进行描述性定量分析（QDA）[16]。由12位气味判断正常的志愿者组成感官评价小组，对评价员进行风味品评培训后开始测评，每次评定独立进行，环境一致，评定员间无干扰。对样品的茶面、茶汤、叶底、柑香、苦涩味等做出评分，分数由 0~5.00给出，“0”代表差，“5.00”代表最好。按照差异分析评分（ANOVA）的方法，对不同样品进行感官评定，共进行3次品评。

1.3.6 顶空气相离子迁移谱（HS-GC-IMS）条件

样品粉碎并充分混合均匀，称取3.00 g，加入125 mL沸水，沸水浴提取10 min后，称取1.0 mL茶汤于20 mL顶空进样瓶中，孵化后上机检测。顶空孵化温度80 ℃、孵化时间10 min，孵化转速500 r/min。载气为高纯氮气（≥99.999%），色谱柱类型为FS-SE-54-CB-1（15 m）ID：0.53 mm，色谱柱温度40 ℃、色谱运行时间 50 min，载气的流速梯度设置为 5.00 mL/min保持 2 min，在 10 min内线性增至 50.00 mL/min，在10 min内线性增至150.00 mL/min后保持30 min。顶空进样针温度 85 ℃、进样量 300 μL[17,18]。

1.3.7 顶空固相微萃取/气质联用分析（HSSPME-GC/MS）

准确称量粉碎样品（1.00 g），加入沸水（料液比为l:6 g/mL）在顶空瓶中冲泡密封。气相色谱入口使用65 μm PDMS/DVB固相微萃取头（Supelco有限公司，宾夕法尼亚州，美国）在250 ℃下老化5 min，60 ℃下平衡 5 min，吸收 30 min，最后解吸 3.5 min[19]。

GC/MS：采用弹性石英毛细管柱（HP-5柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm）。进样温度250 ℃，载气为高纯氦（纯度>99.999%）；流速1.0 mL/min，初始柱50 ℃，保温5 min，然后以3 ℃/min升温至125 ℃，保温3 min，再以2 ℃/min升温至180 ℃，柱温180 ℃，保温3 min，最后以15 ℃/min升温至230 ℃，分流比为50:1。离子源为EI，离子源温度为230 ℃，电子能量为70 eV，发射电流为34.6 μA，四极温度为150 ℃，传输界面温度为280 ℃，电子倍增电压为350 V，质量扫描范围为35~400 u[20]。

1.3.8 相对气味活度值（ROAV值）的计算

相对气味活度值用于评价各物质对整体风味的贡献[6]。定义对风味贡献最大的组分的ROAVstan为100，其他挥发性化合物ROAVi计算见下面公式：

式中：Ti、Cri分别为各组分相应的感觉阈值和相对含量；Tstan、Crstan分别为对样品整体风味作出贡献最大组分的相对应的感觉阈值和相对含量。

1.4 数据统计

采用SPSS 12.0和Excel进行数据处理，差异性分析（ANOVA）被用来检查各个不同结果的平均值间的显著性差异，采用 6个平行，取 95%置信度（p<0.05）。

2 结果与讨论

2.1 儿茶素与多糖含量

样品中儿茶素和多糖的含量如图1。儿茶素是茶多酚的主要成分，是茶叶中的重要次生代谢产物，也是决定茶叶品质和生理活性的主要功能成分之一[21]。cpt3的儿茶素含量最高，为5.30%，其他样品的儿茶素含量多寡依次是cpt4（5.11%）、cpt5（5.00%）、cpt2（3.88%），Cpt1中儿茶素含量为0。何青元等人的研究认为茶多酚含量相对较高的茶样其感官品质均高于茶多酚含量相对较低的茶样；咖啡碱含量和糖类物质含量对云南普洱茶的感官品质的影响不是主要因子，但可以适度增进云南普洱茶的内质[22]。从儿茶素相对含量的角度来看，大暑（8月~9月）后采摘的柑制得的青柑茶 cpt3和橘皮普洱茶中的儿茶素含量相差不大，差异范围在0.3%。小暑（7月初）或之前采摘的柑制得的青柑茶cpt2与橘皮普洱茶中的儿茶素含量相差较大，与样品的普洱茶含量直接相关。图1显示多糖含量最高的是cpt4（57.03 mg/g），其次是cpt3（51.81 mg/g）、cpt5（37.75 mg/g）、cpt2（33.95 mg/g）和 cpt1（6.64 mg/g）。cpt4和cpt5是由橘皮（橙红色的柑橘果皮）制得，成熟的柑橘果皮油腔大而饱满，多糖含量最高。cpt1，cpt2和cpt3使用的柑皮是未成熟的青皮，青皮的多糖含量较低。胎柑cpt1中多糖含量最低，cpt1是柑树的胎果，大多数里面没有果肉，摘取之后自然晒干制得。柑皮多糖和橘皮多糖均具有抗氧化活性[23,24]。总多糖含表明，每年寒露或者寒露后采摘加工的青柑茶多糖含量较高，不同产地橘皮丝的多糖含量有显著差异。普洱茶中的茶多糖含量则会受到到发酵工艺及微生物的影响[25]。

图1 青柑茶和橘皮普洱的儿茶素和总多糖含量Fig.1 Contents of catechins and total polysaccharides in green citrus tea and tangerine peel Pu'er tea

2.2 茶氨酸和游离氨基酸的分析

Cpt1、cpt2、cpt3、cpt4和 cpt5中的茶氨酸和游离氨基酸的含量见表1。茶氨酸是茶叶中特有的游离氨基酸，是谷氨酸γ-乙基酰胺，有甜味。茶氨酸含量因茶的品种、部位而变化，具有广泛的药理功效如抗肿瘤、脑神经保护、抗抑郁、增强免疫、改善认知、降血压、抗运动性疲劳等[26]。本研究发现cpt3茶氨酸含量最高，为2.35 mg/100 g，其余样品相差不大，多寡排序依次为cpt5、cpt4、cpt2和cpt1。cpt1作为新会青柑茶的一种特殊类型，虽不含茶氨酸，但是其所含的游离氨基酸最为丰富，有19种，游离氨基酸总量是其他样品的4.14~9.70倍。Cpt2、cpt3、cpt4和cpt5分别含有10、11和6种氨基酸。橘皮普洱cpt5中游离氨基酸总量最低，但与另一个橘皮普洱样品cpt4相近，青柑茶cpt2和cpt3的游离氨基酸总量相近。胎柑cpt1中游离氨基酸含量高、种类多的原因还需要进一步探究。

表1 青柑茶和橘皮普洱中的游离氨基酸Table 1 Content of free amino acids in Citrus Pu'er tea

2.3 茶色素分析

Cpt1、cpt2、cpt3、cpt4和cpt5中的三种茶色素（茶黄素TF、茶红素TR和茶褐素TB）的含量各不相同，见表2。由于cpt1不含普洱，因此不能检测到茶色素。用（TF+TR）/TB的数值表征茶汤的色泽[27]，橘皮普洱cpt4的色泽得分稍高，其次是cpt3和cpt5，cpt1的色泽得分最低。茶黄素是影响茶汤亮度的主要因素，茶棕素引起茶汤呈棕色[28]。茶褐素是儿茶素的最终氧化产物[29]，本研究中TB含量远高于TF和TR，说明茶褐素是影响青柑茶或者橘皮普洱茶汤色、汤质的决定性因素。ΔE*值表明茶色素的浓度与茶汤的总色差成正比。

表2 青柑茶和橘皮普洱的茶色素比较Table 2 Tea pigment of citrus Pu'er tea

2.4 青柑茶和橘皮普洱的QDA分析

五类样品的感官量化描述分析结果见图2，胎柑cpt1的苦涩味和柑皮香味最为显著，茶汤色最浅，评分远不及其他样品。小青柑茶cpt2的风味与其他样品也有明显不同，表现为柑皮香和苦涩味更为强烈，茶汤和茶面的风味轮廓也与其他样品有很大差异。自制橘皮普洱cpt4和cpt5的QDA轮廓近似，苦涩味和叶底的差异较为明显，柑香差异不大。青柑茶 cpt3的QDA风味轮廓在几类样品中位置居中，综合来看有最好的风味呈现。

图2 青柑茶和橘皮普洱的量化描述感官分析Fig.2 Quantitative description and sensory analysis of citrus Pu'er tea

2.5 HS-SPME-GC/MS分析挥发性化合物

为明确样品所含挥发性化合物的主要类别并显示特征，将各类化合物的百分含量合计后用柱状图显示，由图3可见，青柑茶和橘皮普洱的挥发性成分主要是酯类、烯烃类和醇类。五类样品共计含有碳氢化合物（141.48%）、酯类（155.97%）、醇类（59.44%）、酚类（52.58%）、杂氧化合物（26.99%）、酸类（24.09%）、酮类（15.41%）、醛类（5.34%）和含氮化合物（10.22%）。Cpt1的主要挥发性成分为 2-甲胺基苯甲酸甲酯（18.56%）、1,3,8-薄荷醇（16.50%）、γ-松油烯（15.39%）、百里酚（14.36%）。Cpt2含有2-甲胺基苯甲酸甲酯（40.41%）、蒎烯与柠檬烯（8.03%）。Cpt3富含2-甲胺基苯甲酸甲酯（38.63%）和柠檬烯与月桂烯（11.46%）。Cpt4中含有 2-甲胺基苯甲酸酯（34.27%）、碳氢化合物（6.75%）、松油醇（6.26%）、芳樟醇氧化物（4.80%）。Cpt5含有酯类化合物（20.05%）、碳氢化合物（7.09%）、松油醇（5.56%）和芳樟醇氧化物（4.50%）。初步确定青柑茶的主要香气活性成分是柠檬烯、γ-松油烯、蒎烯、2-甲胺基苯甲酸甲酯，橘皮普洱茶的香气活性成分为碳氢化合物、松油醇和芳樟醇氧化物。本研究结果与前人对普洱茶主要风味物质和柑橘皮香气成分的研究较为吻合[30,31]。采用ROAV法进一步确认关键挥发性风味化合物，根据所测风味物质的相对含量和阈值，一般认为，0.1≤ROAV≤1的物质对整体风味起修饰作用；ROAV≥1的物质对整体风味起关键性作用[32]。

图3 青柑茶和橘皮普洱的挥发性化合物相对百分含量Fig.3 Relative composition of volatile components of citrus Pu'er tea

2.6 青柑茶和橘皮普洱茶香气的GC-IMS分析

橘皮普洱cpt5和新会小青柑茶cpt2的气相离子迁移指纹图谱比对如图4所示。两类样品的指纹图谱差异显著，小青柑茶cpt2中含有很多特征挥发性有机物，而这些挥发性物质在橘皮普柑茶中并不存在，这类化合物对青柑茶风味有主要贡献。橘皮普洱中含有的特征指纹峰在青柑茶中有变化，有些物质含量减少，如戊醛、己醛、环己酮等，有些物质含量逐渐增多，如2-己烯-1-醇、苯甲醛等。从GC-IMS的定性分析结果来看，cpt2含有最多特征香气物质，其次是cpt1。Cpt2和cpt3中含有共同的风味化合物：柠檬烯，蒎烯，香芹酚，月桂烯、松油烯、石竹烯等。这些挥发性化合物在普洱茶中不存在[33]，确定其为青柑果皮的特征风味化合物。GC-IMS结合HS-SMPE-GC/MS分析结果以及ROAV分析结果（表3）表明：α-松油醇、柠檬烯、香芹酚、松蒎烯、辛醛、癸醛、紫苏醛、香芹酮、月桂烯、松油烯、乙酸香叶酯和石竹烯是青柑茶的关键特征挥发性化合物。柠檬烯、芳樟醇、蒎烯、松油醇、松油烯等是柑橘果皮的主要风味物质，也决定了柑普茶的风味。随着柑橘的生长，这类化合物的含量逐渐降低，所以自制橘皮普洱茶cpt4和cpt5中这类风味物质反而不存在，其机理有待进一步阐明。本研究中，GC-IMS定性结果与QDA结果以及GC/MS分析结果有一致性，GC-IMS技术能高效快速识别青柑茶和橘皮普洱的特征香气化合物并表征风味品质差异。

图4 小青柑茶Cpt2和橘皮普洱cpt5的气相离子迁移谱指纹图谱Fig.4 Comparison of gas phase ion mobility fingerprints of cpt2 and cpt5

表3 GC-IMS定性的青柑茶关键挥发性化合物Table 3 Volatile compounds identified by GC-IMS in green citrus Pu'er tea

3 结论

青柑茶的游离氨基酸种类和含量均高于自制橘皮普洱，胎柑cpt1作为新会青柑茶的特殊类型，其所含的游离氨基酸总量最高，为421.21 mg/100 g。粒径大小约50 mm的新会青柑茶cpt3的茶氨酸和儿茶素含量最高，分别为2.35 mg/100 g和5.30%，表现出更高的生理活性和营养价值。样品的多糖含量则与柑皮的成熟程度及普洱的发酵工艺直接相关。随着青柑皮的成熟，青柑茶的多糖含量呈现逐渐升高的规律，升高到51.81 mg/g，感官QDA分析、茶色素和色差测定结果均表明随着青柑皮的成熟，青柑茶茶汤的色泽逐渐变深但陈皮香气逐渐变淡，茶褐素的含量逐渐增加。自制的橘皮普洱cpt4的多糖含量最高，为57.03 mg/g。两种橘皮普洱茶表现出相近的风味和稳定的偏黯红的茶汤色泽。GC-IMS结合HS-SPME-GC/MS以及ROAV分析新会青柑茶和橘皮普洱的风味差异，初步确定新会青柑茶的主要香气活性成分是柠檬烯、γ-松油烯、蒎烯、2-甲胺基苯甲酸甲酯，正是由于这些香气化合物，新会青柑茶才具有其独特的清新风味。橘皮普洱茶的香气活性成分为碳氢化合物、松油醇和芳樟醇氧化物。这些化合物同时也可以视为橘皮普洱特色风味的香气活性物质。本研究发现α-松油醇、柠檬烯、香芹酚、松蒎烯、辛醛、癸醛、紫苏醛、香芹酮、月桂烯、松油烯、乙酸-香叶酯和石竹烯是青柑茶的关键特征挥发性化合物。从营养和风味两方面综合考量考量，青柑茶cpt3更具备柑普茶的典型特性，值得推广。