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肉桂多酚清除自由基及抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力

2021-09-02龙晓珊廖森泰刘书成刘凡黎尔纳庞道睿穆利霞王卫飞邹宇晓

现代食品科技 2021年8期
关键词:亚铁螯合肉桂

龙晓珊,廖森泰,刘书成,刘凡,黎尔纳,庞道睿,穆利霞,王卫飞,邹宇晓

(1.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所,农业农村部功能食品重点实验室,广东省农产品加工重点实验室,广东广州 510610)(2.广东海洋大学食品科技学院,广东省水产品加工与安全重点实验室,广东省海洋食品工程技术研发中心,广东省海洋生物制品工程重点实验室,广东湛江 524088)(3.岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心,广东茂名 525000)

肉桂,最早作为中药材记载于《神农本草经》,其又名玉桂、牡桂、玉树、大桂、辣桂、平安树、中国桂皮,为樟科樟属植物,广泛种植于广东、广西、云南、福建、贵州等地,肉桂的干燥树皮,是著名的药食两用植物,具有抗氧化、抗炎症、免疫调节、抑制肿瘤、降低血糖、以及神经保护等药理作用[1-6]。

肉桂富含多糖、多酚、挥发油等活性物质,其中,肉桂多酚是肉桂的重要组成成分,主要由类黄酮类、类黄酮多聚体化合物组成,包括儿茶素,表儿茶素,甲基羟基查耳酮,表没食子儿茶素没食子酸酯等单体酚[7,8]。现代研究表明,肉桂多酚具有较强的还原性,酚羟基与氧结合,并清除生物体内的自由基,抑制脂质过氧化而保护机体的肝肾,具有明显的抗氧化活性[9-12]。Tulini等表明肉桂酚类物质对活性氧簇和活性氮簇自由基具有较强的清除能力,显示出明显的抗氧化活性,可以用于开发新的功能性食品和保健品[13]。而且,肉桂多酚还可以通过干扰多种氧化应激和促炎途径,从而达到抗氧化的作用[14]。Qin等研究肉桂多酚能够抑制TNF-α等促炎因子的表达,增强脱乙酰酶的蛋白质水平,提高大鼠C6胶质瘤细胞的抗氧化能力[15]。Li等发现肉桂多酚通过抑制iNOS和NF-κB等促炎因子的活化来减轻细胞毒性,提高其抗氧化和降血糖活性[16]。另外,肉桂多酚已被证实具有显著的降血糖作用,其作用机制可能是肉桂多酚可以减轻机体氧化应激和炎症反应,对胰腺β细胞起到保护作用,也有可能是其对α-葡萄糖苷酶具有抑制作用,调节机体对葡萄糖的吸收代谢,从而达到降血糖的目的[17-20]。Panickar等研究发现肉桂多酚具有抗氧化和胰岛素增强作用,缓解细胞肿胀和炎症,具有显著的降血糖作用[21]。Cheng等研究肉桂多酚的降血糖活性,结果表明肉桂多酚明显抑制磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶的基因表达,减少肝葡萄糖生成,抑制α-葡萄糖苷酶活性,降低空腹血糖值,同时改善胰岛素的敏感性,从而改善糖尿病[22]。

本研究以肉桂多酚为研究对象,通过测定肉桂多酚对ABTS+、Fe3+、DPPH、OH-等自由基的清除能力以及对α-葡萄糖苷酶的抑制能力,研究肉桂多酚的体外抗氧化和降血糖作用,为肉桂多酚的开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肉桂产自广东省肇庆市高要区,选取无污染、无病虫害、外表平整的干燥肉桂,将其粉碎后,过 40目筛,得到颗粒均一的肉桂粉末。

硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸(分析纯)购自天津市福晨化学试剂厂;维生素C(Vc,分析纯)购自天津市大茂化学试剂厂;无水乙醇(分析纯)购自南昌市蓝翔化工有限公司;甲醇、乙腈(色谱纯)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;福林酚试剂(Folin-Ciocalteau)购自上海荔达生物科技有限公司;DPPH 购自齐云生物技术有限公司;2,2’-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS)二铵盐、铁离子还原力(ferric ionreducing antioxidant powe,FRAP)试剂盒购自碧云天生物技术公司。

1.2 仪器与设备

1200 series高效液相色谱仪,美国Agilent公司;Sorvall Stratos高速冷冻离心机,美国Thermo Scientific公司;UV-1800紫外分光光度计,日本岛津公司;万能粉碎机,天津市泰斯特仪器有限公司;Infinite M200PRO酶标仪,瑞士Tecan公司。

1.3 样品的制备

精确称取一定质量的肉桂粉,以0.05 g/mL的料液质量浓度加入 60%乙醇,超声辅助提取 60 min,10000 r/min离心10 min后取上清液,滤渣用同样的方法再次提取,重复提取3次,合并上清液,将上清液浓缩后冻干成粉末,备用。

1.4 测定方法

1.4.1 肉桂多酚含量的测定

焦性没食子酸标准品的配制:精确称量10 mg焦性没食子酸,用体积分数60%乙醇溶解后定容至100 mL,得到0.1 mg/mL的标准溶液,再稀释成浓度为4、8、12、16、20、24 μg/mL 的标准溶液[23]。

测定:采用福林酚比色法,取1 mL标准品(或样品提取物)于 10 mL试管中,先加入 1 mL Folin-Ciocalteau试剂,混合均匀后加入2 mL 10%碳酸钠溶液,混匀,于25 ℃下避光反应60 min后,测定吸光度值(765 nm)。以焦性没食子酸质量浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线,采用外标法测定多酚含量。

1.4.2 ABTS+自由基清除能力的测定

采用ABTS试剂盒进行测定,于96孔板所有检测孔中加入200 μL ABTS工作液,空白对照孔中加入10 μL蒸馏水,对照检测孔加入10 μL梯度浓度的Vc标准溶液(浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL),样品检测孔加入10 μL样品(质量浓度分别为0.5、1、2、3、4、5 mg/mL),轻轻混匀;室温孵育 2~6 min后在734 nm波长处测定其OD值。ABTS+自由基清除率计算如公式(1)所示

式中:OD样品为肉桂多酚或Vc吸光度值;OD空白为空白对照孔吸光度值。

1.4.3 亚铁离子螯合能力的测定

亚铁离子螯合能力采用FRAP试剂盒测定,于96孔板所有检测孔中加入180 μL FRAP工作液,空白对照孔中加入5 μL蒸馏水,样品检测孔内加入5 μL梯度浓度的样品(质量浓度分别为0.5、1、2、3、4、5 mg/mL),以5 μL梯度浓度的Vc标准溶液(浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL)作为阳性对照,轻轻混匀;37 ℃孵育3~5 min后在539 nm波长处测定OD值。亚铁离子螯合率计算如式(2)所示。

式中:OD样品为肉桂多酚或Vc吸光度值;OD空白为空白对照孔吸光度值。

1.4.4 DPPH自由基清除能力的测定

DPPH自由基清除能力参考[24]的方法并加以适当改进,精确称取0.004 g DPPH,溶解于无水乙醇后定容至100 mL,保存于棕色瓶中避光保存。配制肉桂多酚样品,于测定孔加入20 μL样品和180 μL DPPH;对照孔加入20 μL无水乙醇和180 μL DPPH;空白孔加入200 μL无水乙醇。

测定方法:①检测组:20 μL梯度浓度肉桂多酚/Vc+180 μL DPPH;②对照组:20 μL 无水乙醇+180 μL DPPH;③空白组:200 μL无水乙醇。

将反应液加入酶标板中,避光反应30 min,在酶标仪中测定517 nm波长处的OD值,按式(3)计算DPPH自由基清除率,

式中:OD样品为肉桂多酚或Vc吸光度值;OD空白为空白对照孔吸光度值;OD对照为对照孔吸光度值。

1.4.5 羟自由基清除率的测定

羟自由基清除率采用Fenton体系测定。分别取6 mmol/L硫酸亚铁和6 mmol/L过氧化氢各2.5 mL于试管中混匀,加入6 mmol/L水杨酸7.5 mL,充分混匀后将体系放置在37 ℃水浴中反应15 min,于510 nm波长处测定吸光度A0,向体系中加入1 mL样品,37 ℃水浴反应15 min,于510 nm波长处测定吸光度Ax;用蒸馏水作空白对照,Vc作阳性对照。羟自由基清除率按式(4)计算

1.4.6α-葡萄糖苷酶抑制能力的测定

参照[25]并加以改进,向96孔板中加入50 μL样品和25 μL 1 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液(用0.1 mol/L pH 6.9磷酸盐缓冲液配制),充分混匀后于37 ℃反应10 min,加入25 μL 1.5 mol/L对硝基苯酚α-D-吡喃葡萄糖苷(用0.1 mol/L pH 6.9磷酸盐缓冲液配制),充分混匀后于37 ℃反应30 min,加入0.2 mol/L碳酸钠溶液100 μL终止反应,于405 nm波长处测定OD值,同时设定相同体系下的样品背景对照组(不加酶)、空白对照组(不加样品)。α-葡萄糖苷酶抑制率按式(5)计算,并计算IC50

式中:OD空白为空白对照组吸光度值;OD样品为肉桂多酚或阿卡波糖吸光度值;OD背景为样品背景对照组吸光度值。

1.5 数据统计与分析

2 结果与讨论

2.1 肉桂多酚含量

肉桂多酚由有机溶剂-水复合溶剂提取,超声辅助提取得到,通过福林酚法测定得到肉桂总多酚的含量为64.43 mg/g(干重)。Helal等用福林酚测得肉桂的总酚含量76.6 mg/g(干重)[26],Helal等用福林酚法测得肉桂多酚的含量为43.8 mg/g(干重)[1]。本文的总酚含量与文献的数据有一定的差距,但总体是一致的,可能是因为肉桂多酚的含量与肉桂的品种、产地、提取方法、测定方法等都有一定的关系。杨立锋等[27]研究不同水果的多酚含量,结果显示葡萄、石榴、蓝莓、杨梅、李子、桑椹、黑加仑、山楂的多酚含量分别为 7.1、4.8、8.2、14.8、2.7、19.3、7.9、2.4 mg/g(干重),肉桂的多酚含量显著高于这些水果的多酚含量。

2.2 肉桂多酚的抗氧化能力

自由基是生物体在新陈代谢过程中产生的、对生物体危害较大、毒性较强的一种自由基,会使机体发生氧化应激,产生大量的活性氧簇和活性氮簇自由基,诱发炎症的发生,扰乱机体的新陈代谢,加速机体的氧化和衰老[28-30]。肉桂多酚对自由基的清除能力反应了其抗氧化能力,清除自由基能力越强,则抗氧化性越强。

2.2.1 ABTS+自由基的清除能力

由图1可知,随着肉桂多酚质量浓度的增加,其对 ABTS+自由基的清除能力越强,质量浓度上升到一定程度时,ABTS+自由基的抑制率达到饱和状态。当肉桂多酚质量浓度为0.5 mg/mL时,对ABTS+自由基的抑制率只有 37.09%,质量浓度增加至 3 mg/mL时,对 ABTS+自由基的抑制率高达 95.12%,质量浓度继续增加后,ABTS+自由基的清除率基本上没有变化。由SPSS软件计算得到肉桂多酚和Vc的IC50值分别为0.71、0.12 mg/mL,对照组Vc对ABTS+自由基的清除能力强于肉桂多酚(p<0.05)。肉桂多酚呈现出较好的抗氧化性,其可能的原因是肉桂多酚是由原花青素、芦丁、儿茶素、表儿茶素等单体酚组成,这些单体酚具有较强的清除自由基能力。Tulini等[31]发现肉桂原花青素具有显著的体外抗氧化和降血糖活性,能有效地清除自由基,降低机体氧化应激反应。据报道,儿茶素和原花青素等单体酚与 ABTS+自由基反应,产生共价化合物,主要是机制是 ABTS+自由基的一个分子从多酚中提取一个电子(或氢原子),形成半醌自由基,再生母体底物 ABTS。随后,半醌自由基与 ABTS+自由基的另一分子反应,形成第一个多酚衍生加合物,从而清除生物体内的 ABTS+自由基[32]。

图1 肉桂多酚对ABTS+自由基的清除能力Fig.1 The scavenging effect of cinnamon polyphenols on ABTS+free radical

2.2.2 亚铁离子的螯合能力

亚铁离子螯合能力是指将铁离子与其他基团发生反应生成螯合物,将铁离子还原成亚铁离子,图2表明,肉桂多酚对亚铁离子具有较强的螯合能力,质量浓度为0.5 mg/mL时,亚铁离子螯合能力已经达到63.77%。C D R A M A等研究肉桂酚类物质添加入白巧克力,使白巧克力的亚铁离子螯合能力由 47.6 μg EE/g增加到1060.6 μg EE/g(干重),表现出显著的抗氧化性[33],与本文研究结果一致。同样地,肉桂多酚对亚铁离子的螯合能力也存在剂量依赖性,样品质量浓度越大,其亚铁离子螯合能力越强。由 SPSS软件计算得到肉桂多酚和Vc的IC50值分别为0.27、0.03 mg/mL,对照组Vc对亚铁离子的螯合能力强于肉桂多酚(p<0.05)。Muhammad等研究肉桂与可可粉混合物的亚铁离子螯合能力,结果表明,随着肉桂比例的增加,其亚铁离子螯合能力也逐渐增强,当肉桂的比例分别为 0%、25%、50%、75%时,亚铁离子的螯合能力分别为 555、878、1131、1323、2389 mmol/L AAE/g DW[34],这与我们的研究结果具有相同的趋势,肉桂多酚对亚铁离子的螯合能力具有剂量依赖性。文献报道,酚酸或羧酸基团的共轭碱基本身的负电荷能够通过电子转移反应还原络合物中的铁离子,在酚酸中,咖啡酸、原儿茶酸和没食子酸是最有效的自氧化促进剂,在适宜的pH下,会与铁形成热力学稳定的螯合物[35]。

图2 肉桂多酚的亚铁离子敖合能力Fig.2 The binding ability of cinnamon polyphenols on ferrous ion

2.2.3 DPPH自由基的清除能力

图3结果显示,肉桂多酚对DPPH具有一定的清除能力,同样存在剂量依赖性,但是与ABTS+清除率和亚铁离子螯合率相比,肉桂多酚对DPPH的清除能力增长比较缓慢。当肉桂多酚质量浓度为1 mg/mL时,DPPH清除率达到62.64%,质量浓度增加为5 mg/mL时,DPPH清除率仅增加至77.56%,但总体而言,肉桂多酚对DPPH具有良好的清除能力。由SPSS软件计算得到肉桂多酚和Vc的IC50值分别为0.18、0.04 mg/mL,对照组Vc对DPPH自由基的清除能力强于肉桂多酚。这与文献的结果一致,A G S等研究得到肉桂皮清除 DPPH的能力随着样品浓度的增加而增强,肉桂皮的剂量分别为5、10、15、20、25 μL时,DPPH清除率分别为71.1%、73.5%、76.2%、82.1%、83.6%[36]。Lin等的研究也表明肉桂清除DPPH的能力随着肉桂提取物质量浓度的增加而增强[37]。李月等[38]发现红毛藻多酚对DPPH自由基有一定清除能力,其IC50值为0.313 mg/mL,清除能力略低于肉桂多酚。万红霞等[39]研究广东东药食两用植物的抗氧化作用,结果显示高良姜清除DPPH自由基的IC50值为0.058 mg/mL,清除效果强于肉桂多酚,布渣叶清除 DPPH自由基的IC50为0.164 mg/mL,其清除效果和肉桂多酚相当,橘红(0.525 mg/mL)、佛手(0.759 mg/mL)、藿香(0.793 mg/mL)、肉豆蔻(0.964 mg/mL)、陈皮(1.001 mg/mL)、益智仁(1.467 mg/mL)等的清除效果均弱于肉桂多酚(0.18 mg/mL)。

图3 肉桂多酚对DPPH自由基的清除能力Fig.3 The scavenging effect of cinnamon polyphenols on DPPH free radicals

2.2.4 OH-自由基的清除能力

OH-自由基是最强大的活性氧物种(ROS),可氧化蛋白质、脂类、DNA和糖类,肉桂多酚含有的酚羟基,可与羟自由基发生氧化还原反应,从而将其清除,达到清除羟基自由基的效果,减少机体营养成分的损失[40]。如图4所示,肉桂多酚的供氢能力较强,有效抑制活性氧簇和活性氮簇的活性,对OH-呈现出良好的清除能力,且随着样品浓度的增大,肉桂多酚的清除能力先逐渐增强后趋于平稳,存在剂量依赖性。当肉桂多酚质量浓度为1 mg/mL时,对OH-自由基的抑制率只有48.43%,质量浓度增加至5 mg/mL时,对羟基自由基的抑制率为 78.23%,当质量浓度继续增加,羟基自由基的清除率基本上没有变化。由 SPSS软件计算得到肉桂多酚和Vc的IC50值分别为0.97、0.045 mg/mL,对照组Vc对OH-自由基的清除能力强于肉桂多酚(p<0.05)。文献报道,桑椹清除OH-自由基的IC50为8.13 mg/mL[41],抑制效果明显小于肉桂多酚,有可能是桑椹活性成分中巯基、酚羟基的给电能力与肉桂多酚酚羟基相比较弱。

图4 肉桂多酚对OH-自由基的清除能力Fig.4 The scavenging effect of cinnamon polyphenols on OH-free radicals

2.3 肉桂多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制能力

α-葡萄糖苷酶是碳水化合物代谢的关键酶,可以将机体摄入的碳水化合物分解成葡萄糖,而α-葡萄糖苷酶抑制剂可以通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性,减少葡萄糖的生成,减缓葡萄糖进入血液的速度,从而减少餐后血糖升高,稳定机体的血糖值[25,42,43]。另外,这种抑制会减少消化道以及肠道对碳水化合物的吸收,刺激胰岛素依赖的葡萄糖摄取,激活AMPK,并改善大肠内的微生物群落,减少炎症,从而改善糖尿病的症状[16,44,45]。

由图5可知,肉桂多酚对α-葡萄糖苷酶具有极强的抑制效果,且随着质量浓度增加而增强。当肉桂多酚质量浓度仅为 0.06 mg/mL时,抑制率已经达到77.02%,体现了较好的抑制效果,当质量浓度为0.12 mg/mL时,抑制率高达98.29%,几乎完全能够抑制α-葡萄糖苷酶的活性。由SPSS软件计算得到肉桂多酚和阿卡波糖的IC50值分别为0.048、0.90 mg/mL肉桂多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制能力明显强于对照品阿卡波糖,具有极好的抑制效果。这与A M E等[46]的研究结果相一致,肉桂多酚α-葡萄糖苷酶的IC50值随肉桂多酚含量的增加而减少。乔锦莉等[47]研究发现蓝果忍冬、杨梅、芒果苷对α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50分别为0.933、1.562、164.16 mg/mL,其IC50值均高于肉桂多酚,说明与蓝果忍冬、杨梅、芒果苷相比,肉桂多酚对α-葡萄糖苷酶具有更好的抑制效果。

图5 肉桂多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制能力Fig.5 The inhibition of cinnamon polyphenols on α-glucosidase

3 结论

肉桂多酚含量为64.43 mg/g(干重),对ABTS+、Fe3+、DPPH、OH-等自由基具有明显的清除能力,存在剂量依赖性,自由基的清除能力随着样品质量浓度的增加而提高。肉桂多酚对以上四种自由基的清除能力由强到弱依次为 DPPH>Fe3+>ABTS+>OH-。肉桂多酚对α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制能力,同样存在剂量依赖性,且抑制效果显著高于阿卡波糖对照。因此,肉桂多酚具有较强的体外抗氧化性和α-葡萄糖苷酶抑制能力。

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