薯蓣皂苷对HepG2肝癌细胞增殖的抑制作用

梁玉琼，黄庆，陈梁可，苏晓君，孙珺，刘钰珊

（1.广西中医药大学赛恩斯新医药学院，广西南宁 530222）（2.广西中医药大学第一附属医院药学部，广西南宁 530023）（3.广西壮瑶药工程技术研究中心，广西南宁 530200）

肝癌是世界范围内与癌症致死相关的第 3大原因，每年可导致600多万人死亡[1]。我国是肝癌的高发地区，每年死亡率占全球的55%，且呈逐年上升趋。肝癌常以广泛转移为终点，切除或消融后复发率高[2]。手术和非手术策略已被用于治疗肝癌。到目前为止，包括分子靶向治疗、免疫治疗和基因治疗在内的一些生物学方法已经显示出作为肝癌治疗的潜力。除此之外，包括多柔比星、顺铂和5-氟尿嘧啶在内的药物对肝癌患者的生存也有益处[3]。然而，这些药物的副作用如心脏毒性和神经毒性，限制了它们的临床推广应用。因此，有必要开发高效低毒的肝癌治疗药物。近年来，一些药用植物的天然产物包括姜黄素、苦参碱和白藜芦醇由于其低毒、副作用少、药用价值高等特点，已被基础实验和临床证实为良好的防癌及抗肝癌药物。因此，从药用植物中寻找治疗肝癌的有效天然产物是合理的、可行的。

薯蓣皂苷（dioscin，Dio）是一种可从百合科、薯蓣科、蔷薇科等植物的根茎中提取到的天然药物，中医研究认为薯蓣皂苷具有活血舒筋，消食利水，祛痰，截疟等功效。同时，现代研究证明，薯蓣皂苷具有抗肿瘤、抗真菌、保肝等作用[4-6]，尤其在抗肿瘤方面作用突出。文献报道，Dio抗肿瘤机制可能与其调控细胞增殖、线粒体凋亡途径等通路有关。Zhao[7]等在肝癌细胞的研究中发现，薯蓣皂苷可抑制Huh7肝癌细胞的增殖，并促进其凋亡。同时，本课题组前期研究证实，薯蓣皂苷可促进SMMC7721肝癌细胞凋亡且呈剂量相关性[8]。但薯蓣皂苷对 HepG2肝癌细胞增殖的影响研究较少。基于此，本研究拟通过评价薯蓣皂苷对HepG2肝癌细胞增殖的影响及其抗肝癌机制，为薯蓣皂苷的开发应用和临床用药安全提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

薯蓣皂苷（纯度≧98%）购买于上海源叶科技有限公司（批号：Y06D9Z76750）；人肝癌细胞 HepG2购自中国科学院上海细胞库。

1.2 试剂

胎牛血清、DMEM 高糖培养基，均购自美国GIBCO公司；胰蛋白酶-EDTA消化液、MTT、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），购自北京Solarbio公司；活性氧检测试剂盒、Hoechst33258染色液、线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1），均购自碧云天生物技术研究所；BCA蛋白浓度测定试剂盒，购自武汉博士德生物技术有限公司；β-actin、BAX、BCL-2，均购自美国proteintech公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器

倒置相差荧光显微镜，日本Nikon；电子天平（千分之一），德国赛多利斯科学仪器有限公司；高速冷冻离心机、流式细胞仪，美国Beckman；CO2培养箱、-80 ℃冰箱，美国Thermo；酶标仪，美国BioTek公司；荧光分光光度计，日本岛津公司；电泳仪、半干转膜仪及凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司。

1.4 细胞培养

HepG2肝癌细胞培养在DMEM培养液（含10%灭活胎牛血清）中，置于37 ℃，5% CO2培养箱中常规培养。取对数生长期细胞进行实验。

1.5 MTT法检测细胞增殖能力

取对数生长期 HepG2细胞，调整密度为 3×104个/mL，接种在96孔板上，放入37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h。细胞贴壁后，每孔加入200 µL浓度为0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 μmol/L的薯蓣皂苷，并设不加药的阴性对照组，每组6个复孔。置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h后，每孔加入10 µL MTT（浓度为5 mg/mL）。孵育4 h后，吸弃上清，每孔加入200 µL DMSO，于波长490 nm测定吸光度。

1.6 对细胞形态学的影响

取对数生长期的HepG2细胞接种在6孔板上，调整密度为1.0×104个/mL，孵育24 h后，加入薯蓣皂苷使其终浓度为 0、1、2 μmol/L，每组 3 个复孔。37 ℃，5% CO2培养箱培养24 h后，拍照并记录细胞形态。

1.7 Hoechst 33258染色观察细胞凋亡

HepG2细胞的培养，分组及给药方法同1.6。按照试剂盒说明书进行染色，荧光倒置显微镜观察细胞凋亡。

1.8 检测活性氧（ROS）水平

HepG2细胞的培养、分组及给药方法同1.6，按照试剂盒说明书收集、悬浮、孵育、洗涤细胞，流式细胞仪检测荧光信号，采用CXP软件进行分析。

1.9 检测线粒体膜电位（MMP）

HepG2细胞的分组及给药方法同1.6。按照试剂盒说明书对细胞进行染色、洗涤，使用荧光分光光度计检测MMP。

1.10 Western blot法检测蛋白质表达

HepG2细胞的分组及给药方法同1.6，每组6个复孔。提取细胞蛋白，并根据 BCA试剂盒说明书检测蛋白浓度。按照参考文献方法[9]使用 Western blot法检测Bcl-2、Bax的蛋白表达，Image J软件计算条带灰度值。

1.11 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差（x±s）表示。单因素方差分析组间差异，p<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 薯蓣皂苷对 HepG2肝癌细胞增殖能力的影响

薯蓣皂苷属于甾体皂苷，已被证明具有抗肝癌作用[10,11]。Zhang等[12]研究结果表明，薯蓣皂苷可抑制HepG2 肝癌细胞的增殖，1 μmol/L、2 μmol/L 薯蓣皂苷对HepG2的抑制率分别为8%、18%，有剂量依赖关系。本文首先以薯蓣皂苷为研究对象，评价在24 h内0、1、2 μmol/L薯蓣皂苷对HepG2肝癌细胞的增殖抑制及凋亡作用，实验结果如图1所示，薯蓣皂苷处理HepG2肝癌细胞24 h后，可表现出显著的细胞增殖抑制作用，并随着浓度的增加，抑制率不断增强，呈剂量相关性；其中，1 μmol/L、2 μmol/L薯蓣皂苷对HepG2肝癌细胞的抑制率分别为3.13%、41.69%，说明薯蓣皂苷既可有效抑制HepG2肝癌细胞的增殖。

图1 薯蓣皂苷对HepG2肝癌细胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect induced by dioscin in HepG2 cells (±s)

经软件计算，薯蓣皂苷对 HepG2肝癌细胞干预24 h的半数生长抑制浓度（IC50）为4.19 μmol/L。根据IC50，本研究后期选择1 μmol/L、2 μmol/L薯蓣皂苷干预HepG2肝癌细胞24 h，观察薯蓣皂苷对细胞增殖、凋亡及线粒体膜电位的影响及其可能机制。

2.2 薯蓣皂苷对HepG2肝癌细胞形态的影响

细胞凋亡时，细胞形态会发生改变，如细胞皱缩，细胞分布密度减少，细胞变圆脱落，凋亡小体出现等[13]。Zhang 等[12]研究结果表明，1~6 μmol/L 薯蓣皂苷可使 HepG2肝癌细胞细胞质收缩并分离，细胞核凝结。本研究采用不同浓度薯蓣皂苷（0、1、2 μmol/L）干预HepG2肝癌细胞24 h后，倒置显微镜下观察细胞形态改变。结果如图2所示，对照细胞分布密度较多而完整、呈不规则多边形、细胞间分界清晰；而 1 μmol/L薯蓣皂苷组HepG2细胞贴附能力减弱，分布密度稍降低，并偶见少部分细胞变圆脱落死亡；而在2 μmol/L薯蓣皂苷组HepG2细胞分布密度均明显降低，大量细胞出现皱缩、体积变小。说明薯蓣皂苷均可抑制HepG2肝癌细胞的生长，细胞形态发生明显变化。

图2 薯蓣皂苷对细胞形态的影响（×100）Fig.2 Morphological changes induced by dioscin in HepG2 cells(×100)

2.3 薯蓣皂苷对 HepG2肝癌细胞凋亡形态学的影响

Hoechst 33258是一种非嵌入性荧光染料，可以通过染色情况观察受试细胞的凋亡状态，正常细胞的细胞核呈正常蓝色荧光，而凋亡细胞的细胞核表现出致密浓染的现象[14]。结果如图3所示，对照组均未发生凋亡，细胞形态完整，细胞核呈低强度蓝色荧光，未见致密浓染。与阴性对照组比较，给药组细胞发生凋亡，细胞质内呈致密浓染的颗粒状荧光，核膜破裂，具有典型的凋亡特征。说明薯蓣皂苷可诱导 HepG2肝癌细胞发生凋亡。

图3 薯蓣皂苷对HepG2肝癌细胞凋亡形态的影响（×100）Fig.3 The effect of apotheosis morphology induced by various doses of dioscin in HepG2 cell (×100)

2.4 薯蓣皂苷对HepG2肝癌细胞ROS水平及MMP影响的比较

ROS是影响机体保持稳定和细胞信号传导的关键因素。凋亡是一个基因程序化的过程，可以通过多种信号通路触发，其中线粒体途径是目前认为最普遍的凋亡机制和核心。Hong等[15]研究结果表明，200、400、800 ng/mL薯蓣皂苷干预原代肝细胞24 h后，可加速细胞中ROS积累，从而破坏抗氧化酶与ROS之间的平衡，促进其凋亡。结果如图4所示，与对照组比较，1 μmol/L、2 μmol/L 薯蓣皂苷干预肝癌细胞24 h后可显著升高ROS水平（p<0.01），呈剂量依赖性。

图4 薯蓣皂苷对HepG2肝癌细胞ROS水平的影响Fig.4 The effect of ROS level induced by various doses of dioscin in HepG2 cell

线粒体在调节细胞凋亡中具有不可忽视的作用。在细胞凋亡过程中，首先引起活性氧大量增加，进而引起一系列与线粒体有关的生理活动，如MMP下降。细胞染色后，当MMP水平较高时发出红色荧光；反之，发出绿色荧光。结果如图5所示，与对照组比较，1 μmol/L、2 μmol/L薯蓣皂苷干预HepG2 肝癌细胞24 h后，红色荧光减少绿色荧光增多，红色荧光/绿色荧光比例下降（p<0.01）。说明薯蓣皂苷可显著降低HepG2肝癌细胞MMP水平，导致线粒体膜不稳定。

图5 薯蓣皂苷对HepG2肝癌细胞线粒体膜电位影响Fig.5 The effect of mitochondrial membrane potential induced by various doses of dioscin in HepG2 cell

2.5 薯蓣皂苷对HepG2肝癌细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

Bcl-2、Bax是线粒体细胞凋亡通路中的重要因子，两者表达水平的高低与细胞凋亡紧密联系[16]。上调的Bax和下调的Bcl-2可首先调节细胞色素C，进而激活Caspase级联反应，最终诱导细胞发生凋亡。抗凋亡因子Bcl-2维持线粒体的完整性，Bax破坏线粒体的完整性。Kim等[17]报道，不同浓度薯蓣皂苷（20 μM、30 μM、40 μM）干预HepG2肝癌细胞24 h后，薯蓣皂苷能够通过下调Bcl-2的表达和上调Bax的表达抑制HepG2肝癌细胞增殖，促进细胞发生凋亡。为了证明薯蓣皂苷可以抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，本实验进一步检测线粒体通路中必需蛋白的表达。本研究结果如图6所示，随着浓度的增加，薯蓣皂苷能显著抑制HepG2肝癌细胞中Bcl-2蛋白的表达，上调Bax蛋白的表达，与对照组比较有显著差异（p＜0.01）；2 μmol/L薯蓣皂苷组 Bcl-2、Bax相对表达量分别为0.08、0.10，区别于其他各组。说明薯蓣皂苷干预HepG2肝癌细胞24 h后，破坏线粒体完整性，并影响线粒体凋亡通路，调控Bcl-2、Bax的表达，进而诱导细胞发生凋亡，最终抑制肝癌细胞的发展。

图6 薯蓣皂苷对HepG2肝癌细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达的影响Fig.6 Effect of dioscin on protein expression of Bcl-2, bax in HepG2 cells

3 结论

在薯蓣皂苷的干预下，HepG2肝癌细胞的体外增殖受到抑制，当给药剂量从1 μmol/L增加至2 μmol/L时，HepG2肝癌细胞的增殖抑制率由 3.13%上升至41.69%；给药组细胞呈致密浓染的颗粒状荧光，核膜破裂，细胞发生凋亡；大量ROS释放，MMP降低；线粒体细胞凋亡通路中的重要因子Bax的表达升高，Bcl-2的表达下降。说明薯蓣皂苷可抑制HepG2肝癌细胞增殖，影响线粒体功能，其凋亡机制可能是通过调控线粒体凋亡途径中的ROS与凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表达，最终诱导细胞发生凋亡。目前本研究仅从体外实验探讨薯蓣皂苷的抗肝癌故为保证薯蓣皂苷的开发应用，后期本课题组还会从动物实验深入研究其“量-毒-效”关系及机制。