2017-2019年我院高毒力肺炎克雷伯菌毒力基因的分子流行特征

李小丽, 邱世洁, 范晓怡, 刘菊珍, 黄云祖, 余广超*

(1. 暨南大学 附属第一医院 临床检验中心, 广东 广州 510630; 2.佛山市妇幼保健院 临床检验中心, 广东 佛山 528000)

高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulenceKlebsiellapneumoniae，hvKP)是在1986年从我国台湾地区1例原发性肝脓肿伴眼内转移感染的患者中首次分离得到的[1].由于其易感宿主多为年轻健康人群，易导致高度浸润性感染(如化脓性肝脓肿、骨髓炎、眼内炎等)，经培养后菌落多具有高黏液性等特征而逐渐引起临床医生的广泛关注[2-4].有研究[5]称在北京地区hvKP可能取代传统肺炎克雷伯菌，成为医院和医疗相关的主要病原体，需持续监测，以确定这一趋势是否正在其他地方发生.目前将具有黏液表型调节基因A(RmpA)和活性铁载体中的气杆菌素(aerobactin)作为判定hvKP的条件之一[6].另有研究[7-8]指出血清荚膜型K1、K2、K5、K20、K54、K57与hvKP感染具有较强的相关性，其中以K1、K2型最为常见.本研究主要对我院2017至2019年筛出的全部hvKP进行相关毒力基因及荚膜血清型的检测，旨在揭示我院hvKP毒力基因的分子流行特征，为其所致临床感染的防治提供实验室依据.

1 材料与方法

1.1 菌株来源

收集暨南大学附属第一医院2017年9月至2019年9月从临床患者标本中分离保存的拉丝试验阳性的肺炎克雷伯菌共51株，所有菌株均以脱纤维绵羊血-76 ℃超低温冰箱保存，临用前复苏.

排除标准：有杂菌污染的菌株、同一病人重复分离的菌株以首次分离为准.

参考相关文献[4,9-10]，本研究将侵袭性肺炎克雷伯菌感染定义为：在排除污染的前提下，从血液、脑脊液、肝脓肿穿刺物、胸腹水、病理组织、胆汁和导管标本中一次或多次分离培养出单一致病菌为肺炎克雷伯菌.

1.2 hmKP与hvKP的判定标准

采用拉丝试验筛选出高黏液性肺炎克雷伯菌(hypermucoviscosityKlebsiellapneumoniae，hmKP)，即用接种环挑起在37 ℃培养箱中培养16～18 h的单一新鲜菌落，若菌落可连续两次挑起长度>5 mm的黏液丝为拉丝试验阳性.本研究参考Russo等[11]学者判定hvKP的标准：(1)拉丝试验阳性；(2)毒力基因RmpA阳性；(3)毒力基因aerobactin阳性，当同时满足以上3个条件方可判定为hvKP.

1.3 hmKP血清荚膜型及毒力基因检测

1.3.1 煮沸法[12]提取细菌DNA模板

用接种环在哥伦比亚血琼脂培养基上挑取适量菌落混于装有250 μL灭菌注射用水的高压后EP管中；其后置于100 ℃恒温金属浴及-76 ℃低温冰箱各10 min，反复冻融3次；最后14 000 r/min离心3 min，吸取上清液至经高压灭菌后的500 μL EP管中，上清液即为细菌DNA模板.

1.3.2 hmKP常见血清荚膜型及毒力基因引物对的设计与合成

参考国内外现有文献报道，利用Primer5.0软件设计RmpA和aerobatin引物对、常见血清荚膜型(K1、K2、K5、K20、K54及K57)及16种毒力基因引物对(表1、2、3)，合成由华大基因有限公司完成.

表1 毒力基因RmpA和aerobactin引物序列

表2 hmKP常见血清荚膜型基因引物序列

1.3.3 PCR反应体系及参数设置

PCR反应总体积25 μL，包括：PremixTaq预混酶10 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板3 μL，灭菌注射用水补足至25 μL.血清型扩增条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸7 min；毒力因子扩增条件：95℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min.

1.3.4 PCR扩增产物电泳

电泳条件为：电压110 V，电泳时间60 min，电泳结束后通过ALPEP凝胶成像仪拍摄电泳图片判读实验结果.目标条带送至天一辉远生物科技有限公司进行DNA双向测序.应用DNAStar、Chromas、Primer5、Alignx软件对测序结果进行拼接、确认及校正，并将校正后拼接结果上传数据库进行比对.

表3 hmKP常见毒力基因引物序列

2 结果

2.1 hmKP的筛选

2017年9月至2019年9月从暨南大学附属第一医院临床标本中分离出的非重复肺炎克雷伯菌共552株，其中来源于侵袭性肺炎克雷伯菌感染标本(血液、脑脊液、肝脓肿穿刺物、胸腹水、病理组织、胆汁、导管)共102株，约占18.47%(102/552)，而经筛选后拉丝试验阳性的肺炎克雷伯菌即hmKP共51株，约占9.24%(51/552).这51株hmKP主要分离自痰液和血液，分别占41.18%(21/51)，27.45%(14/51)，来源科室以ICU、消化内科、呼吸内科居多，分别占37.25%(19/51)，19.61%(10/51)，9.80%(5/51).其中有26株来源于上述侵袭性肺炎克雷伯菌感染标本，约占25.49%(26/102)，属于侵袭性hmKP感染；这其中分离自肝脓肿穿刺物的有7株，部分患者腹部CT如图1所示.另外25株标本则分离自呼吸道和泌尿生殖道，属于非侵袭性hmKP感染.

图1 患者肝脓肿CT影像

2.2 hvKP的筛选

根据方法中hvKP的判定标准，51株hmKP中有43株可判定为hvKP，阳性率为84.31%(43/51).其中在引起非侵袭性感染的25株hmKP中有18株hvKP，阳性率为72.00%(18/25)，在引起侵袭性感染的26株hmKP中有25株hvKP，阳性率为96.15%(25/26).而这25株hvKP对大部分抗菌药物表现为敏感，其中对头孢曲松、氨曲南、庆大霉素、环丙沙星、左旋氧氟沙星、妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦、美罗培南、亚胺培南的敏感率高达100%，在耐药表型上亦未发现对碳青酶烯类抗菌药物耐药.

2.3 血清荚膜型K的分布检出情况

2017至2019年间分离的43株非重复分离的hvKP血清荚膜K的分布情况如下：K1、K2型为hvKP主要的血清荚膜型，分别占41.86%(18/43)、23.26%(10/43)，其余K20、K57、K54、K5分别占13.95%(6/43)、6.98%(3/43)、4.65%(2/43)、2.32%(1/43)，部分扩增电泳结果如图2所示，部分K1测序波形图如图3所示，比对结果如图4所示.另外，在43株hvKP中有3株不属于本研究中的这6种常见血清荚膜型，暂未对这3株作进一步的分型.

M:DL2000marker, 1:K1, 2:K2, 3:K5, 4:K20, 5:K54, 6:K57

图3 部分K1测序波形图

图4 K1测序比对结果

2.4 毒力基因检出情况

本研究对43株hvKP进行了相关文献中常见的18个毒力基因的特异性扩增和电泳，部分电泳结果如图5所示.

M:DL2000marker, 1:RmpA, 2:magA, 3.Aerobactin 4:Kfu, 5:entB, 6:irp-1, 7:irp-2, 8:ybtS, 9:fyuA, 10:wcaG, 11:ureA, 12:allS, 13:mrkD, 14:fimH, 15:Kpn, 16:ycfM, 17:uge, 18:wabG

43株hvKP中18种毒力基因检出率：(1)促进荚膜多糖产生相关基因：RmpA、MagA基因检出率分别为100%(43/43)、41.86%(18/43)；(2)摄铁系统相关基因：Aerobactin、Kfu、entB、irp-1、irp-2、ybtS、fyuA基因检出率分别为100%(43/43)、46.51%(20/43)、100%(43/43)、81.40%(35/43)、83.72%(36/43)、81.40%(35/43)、79.10%(34/43)；(3)菌毛定植与黏附相关基因：wcaG、ureA、allS、mrkD、fimH、Kpn、ycfM基因检出率分别为81.40%(35/43)、93.02%(40/43)、83.72%(36/43)、90.70%(39/43)、88.37%(38/43)、76.74%(33/43)、100%(43/43)；(4)脂多糖形成相关基因：uge、wabG基因检出率分别为90.70%(39/43)、93.02%(40/43)，如图6所示.

图6 hvKP毒力基因检出率

3 讨论

为了解2017至2019年我院高毒力肺炎克雷伯菌毒力基因的分子流行特征，本研究回顾性统计了3年内我院分离自临床的非重复肺炎克雷伯菌共552株，发现痰液和尿液为主要标本来源，以ICU和呼吸内科为主要分离病区，这与KP的致病特点——最常导致呼吸系统感染及泌尿系统感染，易感人群常为免疫功能受损的老年人[11]相吻合.而经拉丝试验阳性判定为hmKP的菌株共51株，约占总体的9.24%.通过对51株hmKP进行RmpA和aerobactin两毒力基因的筛查，共选出满足本研究定义的hvKP共43株，特异性为84.31%(43/51).由此可说明拉丝试验(string test，ST)可作为微生物实验室初步筛选hvKP的一种简单方法，但仅以此作为判断依据却不够严谨[20].

目前将仅具有高黏液表型的KP定义为hmKP，认为hmKP和hvKP是肺炎克雷伯菌中的两个不同表型的种[9]，其高黏液性和高毒力性无明显相关性，故判断是否为hvKP菌株还需进一步检测其相应的毒力基因.而hvKP较非hvKP具有更强的毒力主要有以下两个原因：一是由于hvKP的荚膜多糖产生增多从而导致抗吞噬作用、抑制早期炎症反应、抵抗补体杀菌能力、抑制树突状细胞的成熟等能力增强，表型上则体现为高黏液表型[21]；二是hvKP拥有一套较非hvKP更多且更成熟有效的铁载体系统，其通过分泌数量更多、活性更强的铁载体以帮助细菌抵抗机体的杀菌作用，提高细菌的摄铁率从而表现为更强的毒力[22].故目前将具有黏液表型调节基因A(RmpA)和活性铁载体中的气杆菌素(aerobactin)作为判定hvKP的条件之一[6].这与多个研究[23-25]表明hvKP的高毒力性和RmpA及铁载体，如aerobactin(气杆菌素)、yersiniabactin(耶尔森菌素)、salmochelin(沙门菌素)等有关相符.其中RmpA是荚膜转录激活因子，其可促进KP荚膜的合成和高黏液表型的表达，是判定是否为hvKP的毒力基因之一[26].目前已证实RmpA基因和TerW(亚碲酸盐抗性因子)，iucABCD-iutA(需氧菌素铁离子复合体受体)及SilS(银抗性因子)等基因在hvKP中共同发挥作用，它们同在pLVPK这一质粒上，被命名为pLVPK衍生位点，而pLVPK在大多数经典肺炎克雷伯菌(cKP)中不存在[27].aerobactin(气杆菌素)与RmpA同在pLVPK衍生位点中，由iucABCD-iutA基因簇编码的活性铁载体，主要作用为将宿主组织细胞中的铁运载至细菌中[24].有研究通过建立缺乏aerobactin基因的KP模型证明aerobactin基因的缺失可大大降低肺炎克雷伯菌在体内/外毒性[28]，这也预示着aerobactin基因或许能成为治疗hvKP的一个重要靶点，值得深入研究.

本研究中有7例hvKP分离自肝脓肿穿刺物，且这7例肝脓肿患者在经皮穿刺引流，脓腔冲洗及辅助抗菌药物的使用后均有所好转，与大部分研究[29]中提及的由hvKP所致的肝脓肿病情进展快，容易导致播散性感染、转归差等不相符.可能与这7名患者在病情早期就被及时发现且得到有效的治疗有关，也可能与目前我们标本数量较少、代表性不强有关，但不排除hvKP感染的肝脓肿患者可以通过早期的穿刺引流及抗菌药物的合理应用等综合治疗后控制病情进一步发展可能.

本研究通过对43株非重复hvKP进行血清荚膜型的筛查发现，K1、K2型为主要的血清荚膜分型，分别占41.86%、23.26%，其余K20、K57、K54、K5分别占13.95%、6.98%、4.65%、2.32%，这与目前相关报道称K1、K2型是hvKP中最常见的血清型相符[30]，其中K1与肝脓肿密切相关，K2常引起多样化的侵袭性感染.值得令人注意的是，分离自肝脓肿的hvKP中未检测出强毒力血清型K54，与和晋渝[31]在2012年对重庆、北京、深圳3地共310株KP进行血清型筛查时发现分离自肝脓肿的KP中均未检出K54型相符，这提示我们可以对K54型的hvKP进一步深究，探索其与其他可造成肝脓肿的血清型之间的差异.本研究一共选取了18个毒力基因进行筛选，其中发现magA与K1血清型呈现对应关系，这与大部分研究相符，目前已将magA重命名为wzykp1，为K1型特有的毒力基因[14].18个毒力基因中以ycfM、entB、ureA、wabG在不同血清型检出率均较高，可推测以上4个毒力基因是肺炎克雷伯菌中各种血清型所携带的主要毒力基因.总体而言，2017至2019年我院分离的高毒力肺炎克雷伯菌血清荚膜型以K1、K2为主，毒力基因检出率较高的是ycfM、entB、ureA和wabG毒力基因.

另外，本研究中引起侵袭性感染的25株hvKP对大部分抗菌药物表现为敏感，对碳青酶烯类抗菌药物(亚胺培南、美罗培南)的敏感率高达100%，可推测肺炎克雷伯菌的高毒力与泛耐药之间并不一定存在着相关性，需要进一步探索.迄今为止，造成肺炎克雷伯菌高毒力的影响因素复杂多样，具体机制尚不明确，仍需依靠二、三代测序，转录组学等更多的生物信息学的方法，帮助了解高毒力和高黏液性之间的联系与区别及高毒力具体的致病机制.

作者贡献声明

李小丽：设计实验、统计分析数据，撰写论文；邱世洁：辅助实验;范晓怡：保存菌株，收集菌株相关临床信息并分析记录；刘菊珍：参与论文的选题和设计，修改和完善临床数据的相关统计分析；黄云祖：完善实验方案的具体流程，并对实验过程中的关键性步骤进行相关指导；余广超：提出研究思路和框架，修改论文.

利益冲突声明

本研究未受到企业、公司等第三方资助，不存在潜在利益冲突.