猪多次内服多西环素可溶性颗粒的药代动力学研究

郭桂芳 , 张希墨 , 吴琴尧 , 邱基程 , 王 杰 , 李淑媛 , 张 璐 , 龚晓会 , 郭燕荧 , 刘 欣 , 曹玉颖 , 曹兴元

(1.中国兽医药品监察所兽药审评中心 ， 北京 海淀 100081 ; 2.中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193 ； 3.国家兽药残留基准实验室 ， 北京 海淀 100193 ； 4.河北远征药业有限公司 ， 河北 石家庄 050049)

多西环素是一种半合成的四环素类广谱抗生素，作用机制为抑制核糖体的蛋白质合成，主要是与细菌核蛋白体的30S小亚基结合，具有高效、长效、广谱等特点，广泛应用于兽医临床[1]。盐酸多西环素主要用于对多西环素敏感的胸膜肺炎放线杆菌所引起的猪呼吸道疾病的治疗。兽药市场上存在的剂型有盐酸多西环素可溶性粉、盐酸多西环素注射液、盐酸多西环素片、盐酸多西环素颗粒、盐酸多西环素子宫注入剂等[2]，并且国内外有较多关于多西环素制剂在猪、羊、兔和牛等动物体内单次使用的药代动力学研究报道[3-7]，而对于盐酸多西环素制剂在动物体内多次使用的研究很少。本试验以10 mg/(kg·bw)剂量经口连续5次灌服给予多西环素可溶性颗粒进行猪的多次内服给药药代动力学研究，获取了相关的药动学参数，研究结果将对多西环素制剂在猪病临床上的合理应用提供科学依据。

1 材料与方法

除特殊注明外，本试验所用试剂均为色谱纯，由Milli-Q超纯水仪制取的超纯水，符合GB/T 6682二级用水规定。

1.1 试剂与药物 多西环素可溶性颗粒(规格100 g∶50 g， 批号：120518)，由河北远征药业有限公司提供；盐酸多西环素标准品：纯度≥98.7%，购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；超纯水：由Milli-Q超纯水仪制取；乙腈、甲醇(均为色谱纯)，甲酸(质谱纯)，均购自北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司。

1.2 仪器与设备 超高液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)仪：配电喷雾离子源，厂家：Waters；分析天平：感量0.000 01 g，厂家：德国赛多利斯科学仪器有限公司，型号：R200D；天平：感量0.01 g，厂家：上海舜宇恒平科学仪器有限公司，型号：MP2002；高速冷冻离心机，厂家：德国Eppendorf公司，型号：Centrifuge 58042R；涡漩混合器，厂家：北方同正有限公司，型号：HQ-60-II。

1.3 试剂制备 盐酸多西环素标准储备溶液：准确称取2 mg盐酸多西环素标准品，溶于二甲亚砜中配成1 mg/mL的标准溶液，置-20 ℃冰箱中保存。取储备液依次用乙腈配制成100.0、200.0、1 000.0、5 000.0、10 000.0 ng/mL 和20 000.0 ng/mL标准工作溶液，置-20 ℃条件下保存。

1.4 试验动物 健康三元杂交猪8头(雌雄各半)，试验地点位于北京市海淀区苏家坨周春生养猪场，体重25～30 kg，自由饮水，给药前禁食12 h。

1.5 给药和样品采集 多西环素可溶性颗粒(规格100 g∶50 g，批号：120518)，由河北远征药业有限公司提供。推荐用药方法：以多西环素计。用药前先在饮用水中按0.3 g/L剂量加入柠檬酸调节水的酸碱度，再按用药剂量将盐酸多西环素颗粒加入调节酸度后的饮用水中彻底溶解后使用，药物溶液24 h 更换1次。

三元杂交猪给药前禁食12 h，并称量体重，8头猪以10 mg/(kg·bw) 剂量经口连续5次灌服给予多西环素可溶性颗粒水溶液，每日1次。第1、2、3、4次内服给药前和内服给药后3 h采集血液。第5次给药前和给药后0.16、0.33、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24、36 h和48 h分别于前腔静脉采血5 mL，置于肝素钠抗凝采血管中，3 800 r/min离心10 min，吸取上层血浆放于聚丙烯管中，密封，避光，-20 ℃ 短时保存待用。由于试验过程中第8号猪在第3天灌服给药后发生呕吐现象，将灌服的药物部分吐出，故将该头猪的试验样本剔除并且未进行仪器检测分析。

1.6 检测方法

1.6.1 样品前处理 取血浆50 μL，加入300 μL乙腈，涡动2 min，4 ℃下以8 000 r/min离心20 min，取出上清液，进入UPLC-MS/MS分析。

1.6.2 色谱条件 超高效液相色谱仪：厂家：Waters， 型号：Waters Acquity UPLC；色谱柱：厂家：Waters，型号：BEH C18，2.1 mm×100 mm，粒径1.7 μm； 流动相：0.1%甲酸水溶液∶0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.3 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：5 μL；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution program

1.6.3 质谱条件 质谱仪：Waters Quattro Premier；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；离子源温度：150 ℃；脱溶剂温度：350 ℃；毛细管电压：3.0 kV；脱溶剂气流速：700 L/h； Q1、Q3均为单位分辨率；测定药物定性、定量离子对及对应的锥孔电压、碰撞能量，见表2。

表2 多西环素的定性定量离子对、锥孔电压和碰撞能量Table 2 Qualitative,quantitative ion and cone voltage,collision energy of doxycycline

1.7 数据分析 经建立的UPLC-MS/MS方法对样本检测后，采用Winnolin 8.1药代学软件中的非房室模型分析方法对药时数据进行分析。

2 结果

2.1 分析方法的确证

2.1.1 特异性 分析不同来源的猪空白血浆样品(n=20)，目标化合物的保留时间附近没有杂质干扰。

2.1.2 线性范围 在10～2 000 ng/mL的浓度范围内，方法的线性关系良好，相关系数≥0.99，标准曲线见图1。y=27.123 3x+73.878 5，r2=0.999。

图1 多西环素标准曲线Fig.1 Standard curve of doxycycline

2.1.3 准确度和精密度 本方法在20、500、1 000 ng/mL 三个添加浓度的回收率在96.53%～106.76%；批内变异系数均小于5.28%，批间变异系数均小于6.12%。试验结果见表3。

表3 血浆中添加多西环素的回收试验结果Table 3 The results of doxycycline recovery in plasma

2.1.4 灵敏度 以3倍信噪比测得血浆中多西环素的检测限为5 ng/mL，以10倍信噪比测得血浆中多西环素的定量限为10 ng/mL。

2.1.5 血浆中多西环素药物浓度数据 猪多次内服给予多西环素饮水剂后，血药浓度数据见表4，药时曲线见图2、3。通过药动学软件计算的药动学参数见表5、6。

表4 猪多次内服给予多西环素饮水剂后血浆中的药物浓度Table 4 Drug concentration in plasma after multiple oral administration of doxycycline in swine (ng/mL)

图2 最后1次给药后多西环素在血浆中的药时曲线图(96～144 h,n=7)Fig.2 The drug concentration-time curve of doxycycline in plasma after the last administration (96-144 h,n=7)

图3 猪多次内服多西环素饮水剂后多西环素在血浆中的药时曲线图[3～144 h,10 mg/(kg·bw),n=7]Fig.3 The drug plasma concentration-time curve of doxycycline in swine after multiple oral administration [3-144 h,10 mg/(kg·bw),n=7]

表5 猪最后1次内服多西环素饮水剂后的药代动力学参数[96～144 h,10 mg/(kg·bw),n=7]Table 5 Pharmacokinetic parameters of doxycycline after the last oral administration in swine[96-144 h,10 mg/(kg·bw),n=7]

表6 猪多次内服多西环素饮水剂后的药代动力学参数[3～144 h，10 mg/(kg·bw),n=7]Table 6 Pharmacokinetic parameters of doxycycline after multiple oral administration in swine [3-144 h，10 mg/(kg·bw),n=7]

3 讨论

本试验建立了猪血浆中多西环素的UPLC-MS/MS检测方法，能够满足测定要求，样品测定灵敏度较高。

本试验中，猪连续5 d以10 mg/(kg·bw)的剂量灌服给药多西环素，平均稳态血药浓度Css为(0.66±0.20)μg/mL，波动程度为(169.15±5.24)%，累积指数为1.15±0.03，说明多西环素饮水剂连续灌服无蓄积性。AUC0-τ为(15.91±4.95)(μg/mL)·h，与单次给药时的AUC基本一致。在本试验中，多西环素饮水剂最后1次灌服给药后，其终末消除半衰期(T1/2)约为(8.12±0.84) h，达峰时间(Tmax)和峰值浓度(Cmax)分别为(6.86±1.07)h和(0.52±0.30)μg/mL，平均药时曲线下面积(AUC)为(8.58±0.42)(μg/mL)·h，平均滞留时间(MRT)为(13.05±0.46)h。先前本实验室开展的猪单次内服10 mg/(kg·bw)多西环素饮水剂型水溶液后的药动学结果显示：平均滞留时间MRTlast为(12.82±3.34) h，终末消除半衰期T1/2为(11.65±4.80) h，达峰时间为(4.13±1.89) h，达峰浓度为(0.87±0.48)μg/mL，药-时曲线下面积AUClast为(11.07±4.19) (μg/mL)·h。本次试验中除了AUClast低于单次给药的AUClast外，其他参数差异不大，造成AUClast的前后差异的原因可能是由于动物个体间的变异，此外先前的单次给药平均药时曲线下面积AUC动物个体间数据变异较大，也由于本次试验中所用猪的平均体重比单次药动学试验所用动物少5 kg。

Bousquet等[8]研究发现，猪通过饮水内服盐酸多西环素[每日饮用量在11.8～13.3 mg/(kg·bw)]，连用8 d。 自由饮用药水，累积指数为1.8±0.4，平均血药浓度介于0.7～1.0 μg/mL，消除半衰期为(5.9±1.0)h，与本次试验结果基本一致。Prats等[9]研究发现，猪通过饮水服用盐酸多西环素10 mg/(kg·bw)， 连用5 d。自由饮用药水30 min后，平均血药浓度为0.26 μg/mL，自由饮用药水12 h 后，血药浓度达到稳定状态，介于(0.67±0.82) μg/mL和(2.14±1.66) μg/mL之间，与本次试验的结果基本一致。Mil等[10]研究发现，猪通过单次口服给药多西环素10 mg/(kg·bw)，终末消除半衰期T1/2为(4.83±1.74)h，达峰时间为(2.00±1.10)h，达峰浓度为(2.01±0.91)μg/mL,药时曲线下面积AUC0-inf为(10.56±3.97)(μg/mL)·h，与本试验的结果基本一致。翟克影等[11]研究发现，猪通过灌胃给药盐酸多西环素水溶液5 mg/(kg·bw)，连续给药4 d。药物吸收迅速、分布广泛，消除半衰期为(6.02±0.83) h，药时曲线下面积AUC为(17.07±2.80)(μg/mL)·h，达峰时间为(5.42±0.25) h，峰浓度Cmax为(1.09±0.26) μg/mL。Zhang等[12]研究发现，猪通过肌内注射盐酸多西环素20 mg/(kg·bw)， 其终末消除半衰期(T1/2)约为(8.28±0.91) h，达峰时间(Tmax)和峰值浓度(Cmax)分别为4.00 h和(4.53±0.46)μg/mL，平均药时曲线下面积(AUC0-24)为(55.51±5.72)(μg/mL)·h。盐酸多西环素不同制剂通过不同的给药方式所获得的药动学参数也有一定的差异，由此比较峰浓度大约呈2倍关系于本次口服给药[10 mg/(kg·bw)]，其余参数大致相同，说明口服给药能产生良好的药物作用。Lavet公司在其产品Ladoxyn(盐酸多西环素颗粒)的产品说明中报道，多西环素在猪体内的消除半衰期为4～4.2 h。反复以20 mg/(kg·bw)的剂量给猪口服饮水Ladoxyn 500 mg/g颗粒5 d后， 多西环素的稳态血药浓度范围为1.0～1.5 μg/mL， 该数值约为本次试验结果的2倍，本试验的结果数据基本符合线性相关。比利时Huvepharma公司的HydroDoxx(或DiluDox)50%猪用多西环素可溶性粉的产品说明中报道，猪以10 mg/(kg·bw)的剂量连续饮水给药5 d后，稳态最大血药浓度(Cmax-ss)为 0.83 μg/mL(SD=0.29)，与本试验的结果研究一致。西班牙Divasa公司的50%盐酸多西环素可溶性粉产品说明中报道，以10.8 mg/(kg·bw) 口服后，在猪体内药物治疗的稳态浓度变化由清晨的最小值0.40 μg/mL到傍晚后达到最大值0.87 μg/mL。按10 mg/(kg·bw)服用盐酸多西环素后其稳态的血药浓度在药物治疗后12～96 h内变化为0.75～0.93 μg/mL，与本试验的结果基本一致。

本试验结果显示，多次灌服给药获得的多西环素药动学特征与国外报道的同类制剂基本一致。本试验在推荐给药方案下所获得的药动学参数表明多西环素可溶性颗粒在猪体内具有吸收迅速，达峰时间短，消除较慢，血中平均滞留时间较长的特征，使得药物能够发挥较长时间的药物作用且无蓄积性。在国内没有多西环素在动物体内多次给药的相关研究，本试验为多西环素可溶性颗粒在猪病临床上的应用提供了科学依据。