新疆吐鲁番及阿勒泰主要奶牛产区环形泰勒虫PCR检测及Tams1基因分析

李才善 ， 郭子涵 ， 陈宋琴 ， 马 英 ， 祖力亚·克力木江 ， 刘一凡 ， 李盈科 ， 郭庆勇

(新疆农业大学动物医学学院 ， 新疆 乌鲁木齐 830052)

环形泰勒虫病(Theileriosis)是一种由环形泰勒虫(Theileriaannulata)引起的血液性原虫病，该病在牛群体的所有年龄段都会发生，但主要发生在幼小年龄段[1]。其主要临床症状为引起患病牛体温升高、体表淋巴结肿大、眼结膜黄染、贫血等[2]。环形泰勒虫病的发生具有一定的季节性且多呈急性经过，由于其较高的发病率和死亡率给养牛业带来了巨大的经济损失[3]。该病在新疆地区作为一种常见多发的疾病[4-7]，严重地制约了当地以牛为主的畜牧业的发展。位于吐鲁番地区的托克逊县是新疆地区农牧业资源丰富的地区之一，据统计托克逊县牛存栏量为2.56万头，并且当地的畜牧业仍在不断地发展中[8]。位于阿勒泰地区的富蕴县曾经是新疆三大畜牧县之一，目前仍是重要的畜产品基地，据2011年统计数据显示，当地的牲畜数量为100.97万头[9]。本次试验选择新疆吐鲁番和阿勒泰主要奶牛产区中的托克逊县和富蕴县为试验点，通过PCR方法检测环形泰勒虫在不同地区、不同品种牛等分组中的感染情况，并利用Tams1基因构建系统进化树。旨在为托克逊县和富蕴县2个地区的牛环形泰勒虫病的防控工作提供流行病学参考数据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 树脂型基因组DNA提取试剂盒，购自北京鼎国生物技术有限责任公司；琼脂糖、DL-2 000 marker、核酸染料(GelStain)、2×EasyTaq®PCR Super Mix，均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 主要仪器 PCR仪(型号:BIORAD T100)、紫外凝胶成像仪(型号:Gel Doc2000)，均由美国Bio-Rad公司生产；核酸电泳仪(型号:DYCP-31DN)，由北京六一生物科技有限公司生产。

1.3 样品采集 本试验从吐鲁番地区的托克逊县(n=30)和阿勒泰地区的富蕴县(n=50)共采集牛全血样品80份，将每份牛全血样品收集到装有EDTA-K2的5 mL抗凝管中，并按照不同地区、不同性别、不同年龄段、不同品种对采集的牛全血样品进行分组。为保证血液样品质量，每支抗凝管中收集的血液体积不超过抗凝管总容积的2/3，经温和颠倒混匀后放置于4 ℃环境中，带回实验室进行后续试验。本次试验所采集的牛全血样品信息见表1。

表1 托克逊县和富蕴县牛全血样品采集信息Table 1 Collection information of whole bovine blood samples in Toksun county and Fuyun county (份)

1.4 试验方法

1.4.1 环形泰勒虫PCR检测 按照树脂型基因组DNA提取试剂盒说明书提取牛全血基因组DNA，并在-20 ℃环境中保存备用。参照文献[10]，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成可检测环形泰勒虫的Tams1基因特异性引物(上游引物序列:5′-GTAACCTTTAAAAACGT-3′，下游引物序列:5′-GTTACGAACATGGGTTT-3′)。运用PCR方法进行环形泰勒虫检测，PCR扩增体系：2×EasyTaq®PCR Super Mix 12.5 μL，上游和下游引物各1 μL，牛全血DNA模板1 μL，并加入9.5 μL超纯水将体系补充至25 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃再延伸10 min，扩增结束后取5 μL PCR产物，用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行验证。挑选出验证结果显示阳性的环形泰勒虫PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.4.2 环形泰勒虫系统进化分析 将本试验测序获得的托克逊县和富蕴县2个地区的环形泰勒虫Tams1基因序列通过DNAMAN软件进行同源性分析，并与NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中所上传的相关序列进行BLAST比对。从BLAST比对结果中筛选出不同地区的环形泰勒虫Tams1基因序列，利用贝叶斯方法进行系统进化分析。

1.5 统计分析 采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，使用卡方检验进行差异显著性检验。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 环形泰勒虫Tams1基因的PCR检测 通过PCR扩增得到大小约为721 bp的特异性条带(图1)，与预期的目的片段大小相符。

图1 托克逊县和富蕴县部分血液样品环形泰勒虫PCR检测结果Fig.1 PCR results of Theileria annulata in some blood samples of Toksun county and Fuyun countyM： DL-2 000 maker； P： 阳性对照； 1～3： 托克逊县环形泰勒虫阳性DNA样品； 4～6： 富蕴县环形泰勒虫阳性DNA样品M:DL-2 000 maker; P: Positive control; 1-3: Positive DNA samples of Theileria annulata from Toksun county; 4-6: Positive DNA samples of Theileria annulata from Fuyun county

2.2 环形泰勒虫感染情况 通过PCR方法检测出托克逊县和富蕴县2个地区的牛感染环形泰勒虫的总感染率为31.25%(25/80)。在以不同地区为分组时，托克逊县的环形泰勒虫感染率最高，为40.00%(12/30)，富蕴县最低，为26.00%(13/50)；在以性别为分组时，环形泰勒虫感染率在公牛中最高，为36.84%(7/19)，在母牛中最低，为29.51%(18/61)；在以不同年龄为分组时，环形泰勒虫感染率最高出现在1～3岁的牛群体中，其感染率为50.00%(18/36)，在7～9岁的牛群体中最低，为6.67%(1/15)；在以不同品种为分组时，杂交品种中环形泰勒虫感染率最高，为35.71%(5/14)，在荷斯坦牛中最低，为28.89%(13/45)。通过卡方检验分析发现，环形泰勒虫感染率在不同地区与不同年龄段组内存在显著性差异(P<0.05)，在性别和不同品种组内不存在显著性差异(P>0.05)。分析结果见表2。

表2 托克逊县和富蕴县环形泰勒虫在不同分组中的感染情况Table 2 Infection of Theileria annulata in different groups in Toksun county and Fuyun county

2.3 环形泰勒虫Tams1基因系统进化分析 系统进化分析结果表明，环形泰勒虫托克逊县地方株和富蕴县地方株与河南地方株之间亲缘关系较近，与印度、西班牙等地区的环形泰勒虫地方株之间的亲缘关系较远。基于环形泰勒虫Tams1基因构建的系统进化树见图2。

图2 基于环形泰勒虫Tams1基因构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on the Tams1 gene of Theileria annulata▲: 本文测定的托克逊县环形泰勒虫Tams1基因序列; ●: 本文测定的富蕴县环形泰勒虫Tams1基因序列▲: The Tams1 gene sequences of Theileria annulata in Toksun county were determined; ●: The Tams1 gene sequences of Theileria annulata in Fuyun county were determined

3 讨论

本试验通过PCR方法检测出托克逊县和富蕴县2个地区的环形泰勒虫总感染率为31.25%。其中，托克逊县环形泰勒虫感染率为40.00%，该检测结果低于沙塔尔·卡哈尔等[11]于2013年和何晓东等[12]于2014年所报道的吐鲁番地区环形泰勒虫感染率(51.60%～57.70%)，产生该结果的原因可能是当地加强了对环形泰勒虫的防控工作。对首次进行环形泰勒虫检测的富蕴县，其环形泰勒虫感染率(26.00%)低于本次检测结果中的托克逊县地区的环形泰勒虫感染率(40.00%)。本次环形泰勒虫感染率的检测结果在以性别为分组时发现，公畜的感染率(36.84%)高于母畜(29.51%)；在以不同年龄段为分组时发现，环形泰勒虫感染率在1～3岁的牛群体中最高(50.00%)，在7～9岁的牛群体中最低(6.67%)；在以不同品种为分组时发现，环形泰勒虫感染率在杂交品种最高(35.71%)，在荷斯坦牛中感染率最低(28.89%)。通过卡方检验发现，环形泰勒虫的感染率在不同地区和不同年龄段的分组中存在显著性差异(P<0.05)，在不同性别和不同品种的分组中不存在显著性差异(P>0.05)。上述结果表明，环形泰勒虫在托克逊县和富蕴县2个 地区有着不同的流行情况,且1～3岁的牛群体易感染环形泰勒虫。因此，在实际的牛养殖过程中应该加强对1～3岁牛群体的保护，如有经临床诊断确诊为由环形泰勒虫感染而导致牛患病时，应及时采用有效的治疗方法[2,13-16]进行治疗。

在利用环形泰勒虫Tams1基因序列[17]进行遗传进化分析时发现，环形泰勒虫托克逊县地方株和富蕴县地方株与河南地方株间亲缘关系较近，但与印度、西班牙等其他地区的环形泰勒虫地方株间亲缘关系较远。产生上述结果的原因可能是由于本次试验有限的Tams1基因序列样本数量所导致的。因此，对于2个不同地区的环形泰勒虫地方虫株间的亲缘关系有待进行更深层次的研究。