鸡传染性贫血病毒与鸡细小病毒双重PCR检测方法的建立

张艳芳 ， 谢芝勋 ， 邓显文 ， 谢志勤 ， 张民秀 ， 罗思思 ， 谢丽基 ， 范 晴 ， 曾婷婷 ， 黄娇玲 ， 王 盛 , 刘加波

(广西壮族自治区兽医研究所 广西兽医生物技术重点实验室 ， 广西 南宁 530001)

鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus，CIAV)可引起3周龄以内的鸡严重贫血、出血，尤其是骨髓造血组织和胸腺等淋巴组织严重萎缩，进而导致雏鸡发生免疫抑制[1-3]。鸡细小病毒(Chicken parvovirus，ChPV)属鸡肠道病毒，主要侵害雏鸡，可引起以腹泻、精神抑郁、体温调节障碍、生长迟缓、营养吸收障碍等为特征的急性或慢性肠道性疾病，与矮小综合征和营养不良综合征有关[4-5]，这两种疾病在鸡群中普遍存在，均可引起雏鸡发育不良，严重危害养鸡业的发展，特别是有混合感染时，危害程度尤为明显，给养鸡业造成巨大损失[6]。因此建立有效的检测方法，加强规模化养鸡场对CIAV和ChPV的监测及防控极其重要。多重 PCR可同时检测和鉴别多种病原体，具有灵敏度高、快速、特异性好等优点，且操作简易、能实现标准化[7]，在鉴别诊断多种病原混合感染的临床病例中具有独特的优势[8]。本试验设计了 2 对CIAV和ChPV特异性引物，建立了能够同时检测这两种病毒的双重PCR方法。

1 材料与方法

1.1 主要病原体 CIAV、ChPV、禽肾炎病毒(ANV)、禽流感病毒H9亚型(AIV-H9)、鸡传染性喉气管炎病毒(AILTV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、马立克病毒(MDV)和大肠杆菌(E.coli)，由本实验室保存。

1.2 主要试剂 DNA/RNA提取试剂盒、细菌DNA抽提试剂盒、胶回收试剂盒、2×TaqPCR Mix，均购自北京全式金生物技术有限公司；反转录试剂、pMD 18T Vector、100 bp marker ladder，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 主要仪器 移液枪，购自法国Gilson公司；生物安全柜，购自美国Baker公司；PCR扩增仪、凝胶成像系统，均购自美国Bio-Rad公司；NanDrop ND-2000 微量核酸检测仪，购自美国Thermo Fisher公司；高速离心机，购自美国Beckman公司；电泳仪，购自北京六一仪器公司。

1.4 方法

1.4.1 引物的设计与合成 根据GenBank中CIAV的VP基因和ChPV的NS1基因的保守序列，采用Primer 5.0软件设计引物和DNASTAR软件进行比对筛选，通过NCBI的Blast验证，设计筛选出了2对CIAV和ChPV的特异性引物(表1)。引物由深圳华大基因公司合成。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.4.2 DNA/RNA抽提及反转录 参照核酸抽提试剂盒说明书抽提CIAV、ChPV、MDV和AILTV 的DNA及ANV、AIV-H9、IBV、NDV和ARV的RNA，将RNA反转录成cDNA；同时抽提E.coli的DNA，均保存于-30 ℃ 备用。

1.4.3 反应条件的优化 扩增体系：2×PCR Mix 12.5 μL，CIAV和ChPV的DNA各1 μL作为混合模板，2对引物不同比例共加入2 μL(浓度均为20 μmol/L)，最后用ddH2O补足25 μL。对双重PCR各引物比例进行优化，选择最佳比例，再设置梯度PCR选择最适退火温度，反应条件：95 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 45 s，退火温度50.0～60.0 ℃，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 延伸10 min，12 ℃ 保存。PCR产物经浓度为1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳，拍照保存。

1.4.4 特异性试验 应用优化的双重PCR对AIV-H9、NDV、ARV、MDV、AILTV、IBV和E.coli的核酸进行检测，同时设阴性对照，评价本试验建立的双重PCR方法的特异性。

1.4.5 敏感性试验 使用NanDrop ND-2000 微量核酸检测仪测定CIAV和ChPV的核酸浓度，将已知浓度的模板按 10 倍梯度稀释，逐一进行双重 PCR 扩增，评估本试验建立的双重PCR方法的灵敏性。

1.4.6 临床样品检测试验 采集自2018年11月—2019年5月广西南宁地区规模化养鸡场的 40 份鸡泄殖腔拭子样品，样品采集放入含有双抗的生理盐水中，置于采样箱，当日带回实验室，进行抽提和反转录，应用所建立的双重PCR方法和普通PCR方法分别进行检测，试验重复2次。将目的条带回收，克隆，挑选阳性菌送至赛默飞广州分公司进行测序。

2 结果

2.1 反应条件的优化 最佳引物组合比例：CIAV上下游引物各0.4 μL，ChPV上下游引物各0.6 μL(图1)；最佳退火温度为56.1 ℃(图2)；最佳CIAV和ChPV的双重PCR 反应体系：2×PCR Mix 12.5 μL，2对引物上下游共2 μL，模板混合2 μL，加ddH2O补足25 μL。CIAV和ChPV均可以特异的扩增出相应的目的条带，无非特异性扩增。

图1 双重PCR引物优化试验结果Fig.1 Primers optimization test results of duplex PCRM:100 bp DNA ladder; N: 阴性对照; 1～9:CIAV引物和ChPV引物分别为0.9～0.1 μL和0.1～0.9 μLM:100 bp DNA ladder; N:Negative control; 1- 9:CIAV primer and ChPV primer were 0.9- 0.1 μL and 0.1- 0.9 μL， respectively

图2 双重PCR退火温度优化试验结果Fig.2 Annealing temperature optimization test results of duplex PCRM: 100 bp DNA ladder; N: 阴性对照; 1: 50.0 ℃; 2: 50.7 ℃; 3: 51.9 ℃; 4: 53.8 ℃; 5: 56.1 ℃; 6: 58.0 ℃; 7: 59.2 ℃; 8: 60.0 ℃M: 100 bp DNA ladder; N: Negative control; 1: 50.0 ℃; 2: 50.7 ℃; 3: 51.9 ℃; 4: 53.8 ℃; 5: 56.1 ℃; 6: 58.0 ℃; 7: 59.2 ℃; 8: 60.0 ℃

2.2 双重PCR的特异性试验 CIAV扩增出219 bp的特异性目的条带，ChPV扩增出 384 bp 的特异性目的条带；而AIV-H9、NDV、ARV、MDV、AILTV、IBV和E.coli均没有出现特异性条带(图3)。

图3 双重PCR特异性试验结果Fig.3 Specificity test results of duplex PCRM:100 bp DNA ladder; N: 阴性对照; 1: CIAV和ChPV; 2: ANV; 3: ChPV; 4: AIV-H9; 5: NDV; 6: ARV; 7: MDV; 8: AILTV; 9: IBV; 10: E.coliM: 100 bp DNA ladder; N: Negative control; 1: CIAV and ChPV; 2: ANV; 3: ChPV; 4: AIV-H9; 5: NDV; 6: ARV; 7: MDV; 8: AILTV; 9: IBV; 10: E.coli

2.3 双重PCR的敏感性试验 使用NanDrop ND-2000 微量核酸检测仪测得CIAV和ChPV的浓度分别为66 ng/μL和78 ng/μL，10倍梯度稀释后，对各梯度的模板进行检测。结果表明，本试验建立的双重PCR最低能同时检测到66 fg的CIAV和78 fg的ChPV(图4)。

图4 双重PCR敏感性试验结果Fig.4 Sensitivity test results of duplex PCRM:100 bp DNA marker; N:阴性对照; 1～9: CIAV 66 ng、6.6 ng、660 pg、66pg、6.6pg、660 fg、66 fg、6.6 fg、0.66 fg和ChPV 78 ng、7.8 ng、780 pg、78 pg、7.8 pg、780 fg、78 fg、7.8 fg、0.78 fgM:100 bp DNA marker; N:Negative control; 1- 9: CIAV 66 ng,6.6 ng, 660 pg, 66 pg, 6.6pg， 660 fg, 66 fg, 6.6 fg,0.66 fg and ChPV 78 ng, 7.8 ng, 780 pg, 78 pg, 7.8 pg, 780 fg, 78 fg, 7.8fg, 0.78 fg

2.4 临床样品的检测 使用所建立的双重PCR对40份临床样品进行检测，共检出2份CIAV和ChPV的混合感染、1份CIAV阳性、3份ChPV阳性，重复检测结果一致，并且与单重PCR检测及测序方法得出的结果一致，部分临床样品检测结果见图5。阳性测序结果与相应序列同源性高达96%～99%。

图5 双重PCR临床样品检测结果Fig.5 The detection results of clinical samples by duplex PCRM: 100 bp DNA ladder; P: 阳性对照; N: 阴性对照; 1～11: 检测样品M: 100 bp DNA ladder; P: Positive control; N: Negative control; 1-11: Samples testing

3 讨论

PCR检测方法具有操作简易、特异性强、敏感性高、稳定性好等优点。多重 PCR方法，即在一个体系中加入多种引物和模板[9]，1次PCR就能检测多种病原体，当天就能出结果。建立多重PCR检测方法关键在于引物的设计和筛选，目的片段大小要有合适的梯度，确保产物量相对平衡，目的片段大小相差不宜超过300 bp，各引物退火温度尽可能相近[10]。本试验根据CIAV和ChPV的保守基因序列设计和筛选出2对特异性引物，目的条带大小分别为219 bp和384 bp，通过优化反应条件和体系，确定最佳引物比例分别是CIAV 0.4 μL和ChPV 0.6 μL。设置50.0～60.0 ℃的退火温度梯度，均能特异地扩增出目的片段，56.1 ℃为本试验建立的双重PCR方法最佳退火温度。

通过CIAV和ChPV双重PCR的特异性和敏感性试验，对常见的鸡病AIV-H9、MDV、AILTV、IBV、NDV、ARV和E.coli等进行检测，均没有出现特异性目的条带。最低能检出66 fg CIAV和78 fg ChPV，具有很高的敏感性，完全能够达到快速检测这两种鸡病的目的。

利用本试验建立的CIAV和ChPV双重PCR检测方法，对40份临床样品进行检测，与单重PCR和测序得出的结果一致。因此，本试验建立的双重PCR 检测方法适用于CIAV和ChPV混合感染的快速检测，不仅节约时间、降低成本，还能减少污染，以期为这两种病毒的防控提供参考。