多浪羊发情周期FSH、LH、P4和E2变化规律及早期妊娠鉴定

2021-09-01王艳文布威热比耶姆艾力常卫华

中国兽医杂志 2021年4期

钱伟，王艳文，布威热比耶姆·艾力，雷乔，陈荣，常卫华

(1. 塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔 843300 ； 2. 新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔 843300)

多浪羊是新疆南疆地区非常优良的地方绵羊品种，其肉具有营养丰富、蛋白质含量高等特点，是我国传统的食药两用且对人体健康十分有益的肉食品之一[1]，其体内含有20多种氨基酸[2]，占人类所需要氨基酸的69.27%。新疆具有独特的地理条件及气候，是我国五大牧区之一，羊肉年生产量位居第二，因此养殖业一直都是本地经济发展的主要经济支柱。新疆是一个多民族聚集地，其中维吾尔族和回族人口较多，因此对羊肉的需求量更是超过其他地区。同时大多数地区美食也都离不开羊肉，如羊肉抓饭、烤包子、烤肉等，这些需要优良的羊肉作保证；而且为新疆贫困地区到2020年实现精准脱贫，喀什、和田等地区正在增加投资力度，加大绵山羊等饲养量。目前，南疆的羊饲养量和肉出口量也在逐渐增加[3]。据报道，2013年全疆羊的存栏数达3 621万只，占所有牲畜总存栏数的68%，到2016年底，存栏数达3 915万只，占总牲畜存栏量的81.9%，所以羊是新疆地区畜牧业经济发展最为核心的资源[4]。因此提高多浪羊的繁殖率对新疆畜牧业的发展尤为重要。

羊的需求日益明显，然而南疆地区目前饲养技术及理论的研究相对比较滞后，胚胎移植、人工输精、早期断奶等快繁技术并没有全面的推广，为加快技术的推广及理论研究，达到高效扩繁、帮助贫困人群实现早日脱贫的目的，本试验选择成年多浪羊为研究对象，对其进行早期妊娠鉴定，并用酶联免疫吸附试验(ELISA)技术分析母羊发情周期生殖激素的变化规律，为胚胎移植、胚胎体外生产、生殖生理等相关研究提供理论基础，以达到提高多浪羊繁殖效率和生产效益的目的。

1 材料与方法

1.1 试验动物筛选已生产2胎的多浪羊32只，体重(55±7)kg，布鲁氏菌病检测结果全部为阴性。试验前在隔离栏中隔离45 d，观察其健康状态并做相应的驱虫。隔离之后，确定32只羊均为健康羊只，而后进行随机编号，每天给予全价饲料并保障饮水充足。

1.2 主要材料及仪器孕激素阴道栓(CIDR)，购自新西兰CHH Plastic Moulting Co 公司；注射用血促性素(PMSG)、氯前列醇钠(PG)，均购自宁波第二激素厂；孕酮(P4)、雌二醇(E2)、促黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)酶联免疫分析试剂盒，均购自上海酶联生物科技有限公司。多功能微孔板检测仪，购自美国伯腾仪器有限公司；兽用便携式B型超声诊断仪，购自北京坤泰德医疗科技有限公司；其他常规耗材及试剂，均购自新疆天翼沣生物科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 试验动物的处理试验羊试验前进行45 d的预饲，期间做常规驱虫、观察2～3个发情周期。保证每天有充足的饮水，并且水源清洁；及时打扫羊圈卫生，尽量避免因环境卫生及饲喂而引起的应激。

试验采用CIDR+ PMSG+ PG法对试验母羊进行同期发情，放栓当天记为第0天，第13天撤栓，同时注射PG和PMSG，48 h后每天进行2次发情鉴定，发情的羊进行自然交配，交配后第1天为妊娠期第1天。

1.3.2 血液的采集试验母羊分为A(1～16)、B(17～32)两组，为减少试验误差，每次采血均在北京时间18:00。同期发情放栓当天记为第0天，每组羊隔1天采血1次，最后将二者数据合并。

1.3.3 激素的测定及数据处理用ELISA酶联免疫分析试剂盒测定激素含量，具体步骤按试剂盒说明书操作要求进行。以标准物的浓度为横坐标(X)，OD值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，根据实际测定的OD值查出相应的浓度，再乘以稀释倍数获得激素浓度。

1.3.4 早期妊娠的鉴定试验动物发情期结束17 d后，在妊娠期每隔1周用B超进行直肠观察，分析试验动物妊娠情况。

2 结果

2.1 多浪羊同期发情下FSH、P4、E2和LH的浓度测定

2.1.1 同期发情下FSH测定同期发情中，FSH浓度变化范围为(13.61±2.28)～(29.01±6.15)IU/L，平均浓度在(18.53±6.96) IU/L。第0天的浓度在(14.89±5.25)IU/L，第16 天的浓度在(29.1±6.15)IU/L，达到最高值，即发情前FSH浓度开始显著升高，排卵前达最大值，之后FSH浓度迅速下降，发情后期(第18天)的浓度为(15.3±2.28)IU/L，在整个发情周期中FSH处于较低水平，呈脉冲式分泌(图1)。

图1 FSH浓度变化趋势Fig.1 The change trend of FSH concentration注：放栓当天记为第0天; 下图同Note: The day the suppository was placed was recorded as day 0. The same as below

2.1.2 同期发情下LH测定同期发情中，LH浓度变化范围为(0.3±0.04)～(6.13±0.61)ng/L。第12天之前LH浓度一直处在较低水平，在第6～8天有1个小的波峰，从第12天开始升高，第16天达最高值，随后迅速下降，直到最低水平，变化趋势见图2，和FSH相一致。

2.1.3 同期发情下P4测定同期发情周期中，P4浓度变化范围为(18.44±9.38)～(50.80±3.89)pmol/L。第8天开始浓度快速升高，第9、10、11天的浓度达最大值(50.80±3.89)pmol/L，在整个同期发情周期中，P4从第0～8天浓度处于较低水平，第12天以后又逐渐下降，直到降至最低水平，变化趋势见图3。

图3 P4浓度变化趋势Fig.3 The change trend of P4 concentration

2.1.4 同期发情下E2测定同期发情周期中，E2浓度变化范围为(16.76±1.14)～(58.68±5.46)ng/L，第10天之前E2浓度一直处在较低水平，从第11天浓度逐渐增加，第15天达到最大值，随后又迅速降低，直到最低水平，变化趋势见图4，和P4大体呈负相关。

图4 E2浓度变化趋势Fig.4 The change trend of E2 concentration

2.2 早期妊娠鉴定在对母羊进行妊娠鉴定时，主要通过直肠探查孕囊，妊娠第19天时，子宫扩张，妊娠第28天时可清楚的看到孕囊，第35天时可以清楚的看到较为完整的子叶。见封三彩版图5。

图5 早期妊娠诊断Fig.5 The diagnosis of early pregnancyA：配种后第19天，红色箭头: 扩张的子宫； B：配种后第28天，绿色箭头: 羊水，蓝色箭头: 孕囊； C、D：配种后第35天，黄色箭头: 子叶A: On the 19th day after mating, red arrow: dilated uterus; B: On the 28th day after mating, green arrow: amniotic fluid, blue arrow: gestational sac; C, D: On the 35th day after mating, yellow arrow: cotyledons

3 讨论

3.1 同期发情期生殖激素变化规律的比较 FSH在卵泡生长期间可以刺激卵泡继续发育变大，直到接近成熟。本试验结果显示，FSH在发情前期的浓度较高，黄丽波[5]通过对济宁青山羊初情期前至初情期FSH浓度的测定，发现FSH浓度在发情前期的浓度较高，与本试验的结果基本一致。在发情后期FSH的浓度逐渐减少，邢凤等[6]对和田羊和多浪羊初情期内FSH分泌变化进行研究，试验结果表明，FSH在发情前期、中期的浓度水平高于发情后期，且在发情前期达到最大值，这与本试验的结果相一致。

P4在母羊发情期中具有“启动”作用，能够刺激卵巢的发育态，从而促使母羊再次发情和排卵[7]。动物机体P4的浓度过高时，会抑制E2的分泌，从而能够导致母羊不能发情。在动物处于乏情期时，人为的降低动物机体P4的浓度，能够为动物发情提供前提条件。本试验在整个发情周期中P4的浓度变化范围较小，发情周期第8天P4开始升高，第13天左右又开始下降，符合P4在动物机体的作用机制，该试验结果与黄丽波[5]、贺建宁等[8]的研究结果相一致。

在发情开始前1天E2浓度上升，在发情当天达到峰值，随后在发情结束后，浓度又下降到一个稳定水平。此结果与Esbenshade等[9]、Magness等[10]的试验结果基本一致。但是贺建宁等[8]在试验中对小尾寒羊发情期E2浓度的变化规律研究发现，E2在整个发情期其浓度一直处于稳定水平，差异性不显著。

LH在发情周期的变化规律呈现脉冲式分泌，在发情前1天达到峰值，且仅有1个高峰值，排卵后迅速下降。这与祁云霞等[11]、王忻等[12]在文献中所报道的结果一致。

3.2 早期妊娠鉴定的比较在配种后第19天通过B超可以看到子宫扩张，子宫内有少量液体，第28天可看到孕囊，第35天可清晰的看到子叶。张晓远等[13]曾报道，绵羊早期妊娠的鉴定方法就是能够清晰地看到子宫小叶图像；李昊帮[14]通过试验得出，B超能够在发情配种后第19～20天确认绵羊是否处于妊娠期，在第24天的确诊率为81.25%，第32天的确认率为93.75%，第37天的确认率可达100%。本试验任务在配种后的28 d左右进行B超的妊娠检查，可见孕囊，其准确率较高，本试验结果与文献报道结果相一致。