阿苯达唑对3种金丝猴毛首线虫驱虫效果试验

贾 婷 ， 赵素芬 ， 罗 静 ， 刘连贵 ， 韩姝伊 ， 孙冬婷 ， 冯胜勇 ， 夏茂华 ， 黄菁晶 ， 张轶卓 ， 何宏轩 ， 张成林

(1.北京动物园 圈养野生动物技术北京市重点实验室 ， 北京 西城 100044 ； 2.中国科学院动物研究所 ， 北京 朝阳 100101)

毛首线虫(Trichurussp.)，亦称鞭虫，属毛首目(Trichurata)，毛首科(Trichuridae)，毛首属(Trichuris)线虫[1]。在全球分布，能感染多种动物，是常见且危害严重的胃肠道寄生虫[2]。临床上，圈养灵长类动物对胃肠道寄生虫敏感，尤其以毛首线虫感染率高[3]。金丝猴对毛首线虫极为敏感，感染率高达80%以上，并可引起发病与死亡[4]。轻度感染时，动物出现间歇性腹泻、贫血 ； 严重感染时，动物出现精神沉郁、食欲减退、体温升高、剧烈腹泻、排血色水样粪便并附有黏液，消瘦、贫血，甚至引起动物死亡[5-8]。金丝猴又名仰鼻猴，国家一级重点保护动物，现存5个种，其中川金丝猴(R.roxellana)、黔金丝猴(R.brelichi)和滇金丝猴(R.bieti)3个种为我国特有种。金丝猴的人工饲养始于1955年北京动物园，在我国已有60年的饲养展出历史[9-11]。目前，北京动物园是全国唯一一家同时饲养川、黔、滇3种金丝猴，且这3种金丝猴均能进行繁殖的单位。为保障动物健康，北京动物园兽医工作者每年春、秋进行寄生虫普查，结果显示，金丝猴粪便中存在大量寄生虫虫卵，对虫卵结构进行分析，发现以毛首线虫卵为主。虽然北京动物园未出现毛首线虫致死金丝猴病例，但病原长期存在于动物体内，不仅会对动物机体造成损伤，虫卵随粪便排出体外，也会污染动物饲养环境，感染其他动物。为此，本试验开展北京动物园饲养的川、黔、滇3种金丝猴毛首线虫驱虫试验研究，探索毛首线虫在金丝猴体内的消长规律，以期为金丝猴饲养管理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 3只川金丝猴、4只黔金丝猴和4只滇金丝猴，资料信息见表1。11只受试动物均饲养于北京动物园金丝猴馆内，其饲养环境及食物结构基本一致。试验过程中动物自由采食和饮水，食物为北京动物园金丝猴饲养标准餐，饮水为清洁凉开水。

表1 试验金丝猴信息表Table 1 Information of experimental golden monkeys

1.2 方法

1.2.1 试验药物及给药方法 阿苯达唑(国药准字H12020496，中美天津史克制药有限公司)。兽医根据经验及前期测量数据评估动物体重，按照10 mg/(kg·bw) 剂量将阿苯达唑拌入主食内，由饲养员逐只投喂给动物，确保用药剂量，连续投喂3 d。

1.2.2 毛首线虫虫卵检查 本试验分别于投喂阿苯达唑前3 d，投喂后3、6、9、15、20、25 d和30 d，采集受试动物新鲜粪便，称取1.0 g，采用饱和食盐水漂浮法漂浮虫卵，光学显微镜(Olympus BX51显微成像系统，日本)下观察，麦克马斯特氏法(McMaster’s method)进行虫卵计数，计算每克粪便虫卵数 (Eggs per gram of feces，EPG)[12]、虫卵转阴率及平均虫卵数，分析金丝猴体内毛首线虫的消长规律。

虫卵转阴率(%)=

1.2.3 PCR检测 称取粪便样品中心无污染处0.5 g，按粪便DNA提取试剂盒(D5625-01，OmegaBio-Tek,Inc.,Norcross,USA)说明书提取DNA。采用巢式PCR扩增毛首线虫核糖体DNA内转录间隔I(rDNA ITS1)基因片段。第1轮扩增体系25 μL：2×Taq酶混合溶液(B639295，Life Biotech，India Delhi)12.5 μL，正反向引物(表2)各1 μL，ddH2O 9.5 μL，模版DNA 1 μL；扩增第1轮反应程序：Stage 1：95 ℃ 10 min；Stage 2：95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s(35个循环)，最后72 ℃延伸10 min。第2轮扩增体系25 μL：2×Taq酶混合溶液12.5 μL，正反向引物(表2)各1 μL，ddH2O 9.5 μL，模版DNA 1 μL，模板DNA为第1轮扩增产物；第2轮扩增反应程序：Stage 1：95 ℃ 10 min；Stage 2：95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s(35个循环)，最后72 ℃延伸10 min。2轮扩增产物大小分别为1 088 bp和895 bp[13]。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测第2轮扩增产物，4S Green核酸凝胶染液染色，凝胶成像仪中观察。电泳检测阳性且与目标条带大小一致者，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。所有样品均重复检测3次。

1.2.4 系统发育分析 通过NCBI数据库中的BLAST模块进行序列比对，确定毛首线虫所属类群，选取GenBank中川金丝猴毛首线虫(MN447324.1Trichurissp.-Rhinopithecusroxellana)、黑叶猴毛首线虫(MN447321.1Trichurissp.-Trachypithecusfrancoisi)、人毛首线虫(KJ588071.1Trichurissp.-Homosapiens、GQ352553.1Trichuristrichiura-Homosapiens、GQ301555.1Trichuristrichiura-Homosapi-ens、JN181860.1Trichuristrichiura-Homosapiens)、食蟹猴毛首线虫(MK192054.1Trichuristrichiura-Macacafascicularis)、黑白疣猴毛首线虫(KJ588077.1Trichuristrichiura-black-and-white colobus)、长臂猿毛首线虫(GM991955.1Trichuriscolobae-Nomascusgabriellae)、叶猴毛首线虫(KT186232.1Trichurissp. -leaf-monkeys)、日本猕猴毛首线虫(KP336476.1Trichuristrichiura-Macacafuscata)已有序列和本试验测得的序列，共同构建系统发育树。选择Trichurissp.-Sundamysmuelleri(MN428391.1)序列作为系统发育树的外群。在Jukes-Cantor方法中使用邻近连接算法在MEGA 6.0中进行系统发育分析，使用1 000次 重复的Bootstrap进行分支可靠性分析[14]。

表2 扩增毛首线虫内转录间隔区引物名称及序列信息Table 2 Primers and sequence information of Trichurus ITS

2 结果

2.1 圈养金丝猴毛首线虫形态学鉴定 采用饱和盐水漂浮法和离心沉淀法富集3种金丝猴粪便中的寄生虫虫卵，光学显微镜下观察，3种金丝猴粪便内虫卵均呈棕黄色，外形为腰鼓状，卵壳厚，两端有卵塞，依据形态判定为毛首线虫虫卵(中插彩版图1)。

图1 毛首线虫虫卵(400×)Fig.1 Eggs of Trichuris sp.(400×)

2.2 圈养金丝猴毛首线虫分子生物学鉴定 提取金丝猴粪便基因组，使用巢式PCR 法扩增毛首线虫ITS1基因片段，使用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，目的条带测序，测序结果在NCBI进行BLAST分析，并构建系统进化树进行分析，结果表明，北京动物园川(序列编码：12、29)、滇(序列编码：6、23、25、33、42)、黔(序列编码：35)3种金丝猴粪便中检测到的毛首线虫与秦岭川金丝猴毛首线虫聚为同一分支，属于毛首线虫属(图2)。

图2 圈养金丝猴毛首线虫系统进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of Trichuris sp. of captive golden monkeys▲: 试验动物名称，其中序列编码12、29为川金丝猴，序列编码6、23、25、33、42为滇金丝猴,序列编码35为黔金丝猴▲: Name of the experiment animals. Among them,12,29 is the sequence code of R. roxellana, 6,23,25,33,42 is R. bieti,and 35 is R. brelichi

2.3 圈养金丝猴体内毛首线虫驱虫效果观察 统计检测期内11只受试动物的转阴率及平均虫卵数，结果显示，给药后第6天平均虫卵数降到最低水平，转阴率达到64%，其后24 d内，转阴率及平均虫卵数虽有上下波动，但均未到达驱虫前水平(表3)，可见，阿苯达唑对金丝猴毛首线虫有明显的驱虫效果。

表3 阿苯达唑对圈养金丝猴体内毛首线虫转阴率及平均虫卵数的影响Table 3 Effects of albendazole on negative conversion rate and average egg number of Trichuris sp. of captive golden monkeys

进一步对比阿苯达唑对3种金丝猴驱虫效果，川金丝猴和黔金丝猴的驱虫效果较好，除川金丝猴在驱虫后第10天EPG波动较大外，这2种金丝猴在检测期粪便内虫卵始终维持在较低水平(图3A和3B)；滇金丝猴样品虽在给药后第3天和第6天EPG迅速降低，但在给药后第10～30天，EPG高水平范围波动，虽有驱虫效果，但不如前2种金丝猴理想(图3C)。

图3 驱虫前、后金丝猴EPG随时间的变化Fig.3 Changes of EPG of golden monkeys before and after administrationA： 川金丝猴； B： 黔金丝猴； C： 滇金丝猴A: R. roxellana; B: R. brelichi; C: R. bieti

进一步分析11只受试金丝猴体内毛首线虫消长规律，结果显示：投药前后3只川金丝猴和4只黔金丝猴体内毛首线虫EPG虽然在投药后存在反弹和波动，但阿苯达唑对这2种共7只金丝猴的驱虫效果均较为理想；分析4只滇金丝猴体内毛首线虫消长规律，发现R.bieti-1和R.bieti-2体内毛首线虫消长规律与川、黔2种金丝猴体内毛首线虫EPG变化规律相似，而R.bieti-3和R.bieti-4体内毛首线虫虽在投药后第6天迅速下降，但随着时间推移，其EPG迅速上升，在给药后15～20 d，达到甚至高于2只动物在投药前毛首线虫本底水平，之后二者EPG虽有下降，至投药后第30天，EPG仍维持在3 950 和6 200(中插彩版图4)。

图4 投药前、后11只受试金丝猴体内毛首线虫消长曲线Fig.4 The perishing and growing curve of Trichuris sp. of 11 golden monkeys before and after administration

3 讨论

圈养川金丝猴感染毛首线虫的概率极高，且存在重复感染的现象[8]。根据北京动物园寄生虫普查结果，圈养川、黔、滇3种金丝猴粪便样品中存在大量毛首线虫虫卵，虽然每年定期进行驱虫，普查仍然存在大量虫卵。虽然目前尚未有直接因感染毛首线虫致死的报道[15]，一旦发生混合感染，金丝猴也会发生死亡，如安徽省某动物园曾发生1例川金丝猴金黄色葡萄球菌与毛首线虫混合感染致死的病例[8]，临床上毛首线虫仍然是危害圈养川金丝猴种群健康的重要病原[16]。目前对圈养川金丝猴毛首线虫的研究报道相对较多，但由于圈养金丝猴种群数量相对较少，尤其川、黔、滇3种金丝猴都有饲养的单位全国仅有北京动物园，对比分析这3种金丝猴毛首线虫感染及治疗的报道甚少。因此，本试验可为临床用药和饲养管理提供科学数据。

形态学鉴定是毛首线虫属重要的定种方法[17-18]，但在形态相似近缘种鉴定时，常出现混淆甚至错误，造成寄生虫同种异名和异种同名现象；形态学鉴定方法结合rDNA ITS序列分析可为毛首线虫属物种分类体系提供依据[19]。本试验结合形态学及毛首线虫ITS1序列进行分析，结果显示，北京动物园圈养川、黔、滇3种金丝猴感染的毛首线虫与秦岭川金丝猴毛首线虫聚为同一分支，属毛首线虫属。据Xie等报道，通过比对分析毛首线虫属ITS和cox1基因序列，发现白颊长臂猿、阿拉伯狒狒、长尾猴、东非狒狒、北方豚尾猴和人毛首线虫聚类为一个亚群，川金丝猴和滇金丝猴独立于上述灵长类，形成一个新亚群，提示金丝猴可能存在着不同的毛首线虫物种[20]。

根据北京动物园兽医工作者临床经验，3种金丝猴存在毛首线虫反复感染的现象。本试验给3种金丝猴投喂经典毛首线虫驱杀药物阿苯达唑，结果显示，阿苯达唑对金丝猴毛首线虫具有良好的驱虫效果，尤其是对川金丝猴和黔金丝猴的驱虫效果理想，除川金丝猴在驱虫后第10天EPG波动较大外，这2种金丝猴在检测期粪便内虫卵始终维持在较低水平。可见，临床上阿苯达唑可有效驱除3种金丝猴体内毛首线虫虫卵。然而，毛首线虫的发育不需要中间宿主，在普通环境中3周左右就可以发育成为侵袭性幼虫，高温高湿环境下发育速度更快[21]。加之，金丝猴时而地面取食，环境中的虫卵若未能及时清除，很容易在驱虫后28 d左右就发生重复感染，驱虫后采用火焰消毒可控制环境中的虫卵[4]。为提高动物福利、优化游客观览体验，北京动物园饲养和园艺工作者在金丝猴馆舍内种植大量绿植，圈舍内不宜进行火焰消毒。本试验虽未在驱虫后30 d的检测期出现所有个体重复感染事件，但部分个体虫卵数存在波动，这种驱虫效果波动可能与环境中虫卵存在密切相关，可见使用阿苯达唑驱虫后1个月可以维持动物体内虫体寄生量在一个较低水平。王荣琼等建议金丝猴群每月投服1次驱虫药[6]，而顾永熙等建议金丝猴毛首线虫的驱虫时间间隔应为2.5个月[1]，未来开展北京动物园毛首线虫消长规律，优化药物驱虫程序，开展长效驱虫研究势在必行。

对于滇金丝猴，虽在给药后第3天和第6天EPG迅速降低，但在给药后第10～30天，EPG波动较大，虽有驱虫效果，但不如川、黔2种金丝猴理想。进一步分析阿苯达唑对滇金丝猴毛首线虫驱杀效果的差异，可能受试的4只滇金丝猴年龄跨度大，尤其是R.bieti-3和R.bieti-4分别为19岁和21岁，投喂阿苯达唑后，由于药物作用在短时间内驱杀毛首线虫，高龄动物由于年龄增长而致全身器官功能减退和组织细胞退行性改变等生理病理的变化[22]，机体抵抗力相对较弱，局部药物浓度下降后，寄生虫会逐渐繁殖，重新定植所致。针对高龄动物需要更换其他驱虫药物，或者在驱虫的同时，给予适当补充免疫营养素，增强机体抵抗力，可以间接提高驱虫药的驱虫效果，还可以缓解寄生虫引起的机体应激，修复寄生虫分泌引起的机体损伤[23]。因此，高龄金丝猴驱虫方案及效果有待进一步研究。