液相色谱-串联质谱法检测蜂蜜中酰胺醇类药物残留

◎ 刘 毅，张居舟

（安徽省食品药品检验研究院，安徽 合肥 230051）

蜂蜜是由蜜蜂采集蜜源植物的花蜜或蜜露后，将其贮存于蜂巢内的巢脾中，并经充分酿造而成。成熟蜂蜜是一种具有浓郁花香味的天然甜物质，含有葡萄糖、氨基酸、矿物质、果糖、酶类和抗氧化物等，是对人体有益的天然食品[1]。随着生活水平的提高，人们对蜂蜜的需求量增长迅速，对其品质和质量的要求也越来越高，蜂蜜中兽药残留也逐渐得到人们关注。

酰胺醇类曾被称为氯霉素类抗生素，是抗生素的常用成分，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有很强的杀灭作用，因其广谱的抗菌性被广泛应用于兽医临床，但该类药物经食物链进入人体后会对人体健康构成威胁[2]。酰胺醇类药物在蜜蜂养殖过程中曾被广泛使用，而农业农村部公告第250号已明确指出氯霉素及其盐、酯禁用于所有食品动物[3]。为保障消费者安全，控制酰胺醇类物质在蜂产品中的使用，有必要建立一种灵敏、高效的酰胺醇类物质残留检测技术。

目前，对蜂蜜等蜂产品中的多种酰胺醇类物质（包括琥珀氯霉素，棕榈氯霉素等）的检测方法并不多，本文建立了一种基于液相色谱-串联质谱法[4]检测蜂蜜中酰胺醇类药物残留的方法。试样经乙酸乙酯提取浓缩后用水溶解，Oasis HLB固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱仪测定，氯霉素用内标法定量，氟苯尼考、甲砜霉素、琥珀氯霉素、棕榈氯霉素用外标法定量[5]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters TQ-S超高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪（美国Waters公司）。

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素琥珀酸钠和氯霉素棕榈酸酯的标准物质，氯霉素氚代内标（氯霉素-D5），均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯（色谱纯，质谱纯），德国Merck公司；HLB固相萃取柱：Oasis HLB 6 mL/200 mg，美国Waters公司。其他所用试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液的配制

（1）标准储备溶液的配制。分别称取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素琥珀酸钠和氯霉素棕榈酸酯标准物质5.0 mg，各自置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成500 μg·mL-1的标准储备溶液。准确称取1.0 mg的氯霉素-D5标准物质，置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容至刻度配成100 μg·mL-1的内标标准储备溶液。

（2）混合标准溶液中间液的配制。分别准确移取适量的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素琥珀酸钠和氯霉素棕榈酸酯标准储备溶液，用乙腈稀释成50 μg·mL-1的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考、氯霉素琥珀酸钠和氯霉素棕榈酸酯混合标准溶液中间液。

（3）氯霉素氚代内标（氯霉素-D5）标准溶液中间液的配制。准确移取适量的氯霉素-D5标准储备溶液，用乙腈配成1 μg·mL-1内标中间溶液。

（4）混合标准工作溶液的配制。分别准确移取混合标准溶液中间液及内标中间溶液，用流动相稀释 成 浓 度 为0.1 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1和10.0 ng·mL-1的标准工作溶液。

1.2.2 样品前处理

（1）提取。将蜂蜜置于不超过60 ℃的水浴中振荡，待样品全部融化后搅拌均匀，冷却至室温。称取5 g试样，精确到0.01 g，置于50 mL具塞离心管中，加入氯霉素氚代内标（氯霉素-D5）中间溶液和5 mL水，于涡旋混合器上涡旋混合1 min，使试样完全溶解。加入15 mL乙酸乙酯，在超声波振荡仪上超声振荡10 min，取出试样置于离心机中，以6 000 r·min-1离心5 min，准确吸取上层乙酸乙酯于15 mL离心管中，经氮气吹干，加入5 mL水溶解残渣，待净化。

（2）净化。HLB固相萃取柱分别用5 mL水和5 mL乙腈活化，将待净化液转移到固相萃取柱上，弃去流出液，待溶液完全流出后，依次用5 mL水和5 mL乙腈水溶液淋洗，弃去全部淋出液，抽至近干，用5 mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液于10 mL离心管中，氮气吹干，用1 mL流动相定容，过0.22 μm有机相滤膜[6]，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.2.3 液相色谱和质谱条件

（1）液相色谱条件。色谱柱：BEH C18柱，2.1×50 mm，粒径1.7 μm；流动相：A为含0.1%甲醇的水溶液，B为甲醇。流速：0.3 mL·min-1；柱温：35 ℃；进样量：2 μL。液相色谱梯度洗脱程序为：0～0.5 min，90%A；0.5～5.0 min，90%A～10%A；5.00～5.01 min，10%A～90%A；5.01～7.00 min，90%A。

（2）质谱条件。离子源：电喷雾离子源；检测方式：多反应监测；扫描方式：负离子扫描（ESI-）；毛细管电压：3.00 kV（ESI-）；脱溶剂气温度：440 ℃；脱溶剂气流速：800 L·h-1；锥孔电压：30 V；锥孔气流速：150 L·h-1。

2 结果与分析

2.1 优化质谱条件

在负离子扫描模式下确定目标化合物的母离子和定性、定量离子对并优化质谱的各参数质谱参数优化结果，见表1。

表1 6种化合物质谱参数表

2.2 线性范围与检出限

将5种酰胺醇类药物标准储备液分别配制成0.1 μg·L-1、0.5 μg·L-1、1.0 μg·L-1、2.0 μg·L-1、5.0 μg·L-1和10.0 μg·L-1的溶液进行检测，各类药物的检出限为0.1 μg·kg-1，定 量 限 为1.0 μg·kg-1，线 性 范 围 为0.1～10.0 μg·L-1，对应化合物的线性方程、相关系数见表2，以峰面积为纵坐标，标准溶液质量浓度作为横坐标，绘制标准曲线，各药物线性方程相关系数r＞0.995。酰胺醇类物质总离子图见图1，各单一组分离子对图见图2。

图2 各单一组分离子对图

表2 各类药物的工作曲线及相关系数表

图1 酰胺醇类物质总离子图

2.3 回收率与精密度

选用不含本文5种酰胺醇类药物的阴性蜂蜜样品进行3个浓度水平的加标回收试验[7]，每个浓度的加标试验做6次平行。取各药物的加标量、相应的回收率平均值，结果见表3。

表3 阴性蜂蜜样品中酰胺醇类药物的平均回收率和相对标准偏差表（n=6）

2.4 方法实际应用

在合肥商超随机购买15批次蜂蜜样品，用本文方法进行检测，实验结果均为未检出，未发现酰胺醇类阳性样品[8]。

3 结论

本研究建立了高效液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中酰胺醇类药物残留量。5种酰胺醇类药物在0.1～10.0 μg·L-1的浓度范围内线性关系良好，相关系数r均大于0.995；方法检出限为0.1 μg·kg-1。加标水平在0.1～5.0 μg·kg-1范围内，蜂蜜基质中平均回收率在86.3%～101.0%，相对标准偏差RSD≤6.5%。该方法快速、准确、灵敏，可用于测定蜂蜜中酰胺醇类药物残留。