Rab23基因联合人参皂甙Rg3对胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响

闫磊 周宏博 崔红 梁军 孙晓冬 朱梅 佟雷

(牡丹江医学院 1组胚教研室，黑龙江 牡丹江 157011；2红旗医院；3干细胞研究所；4药剂学教研室)

胶质细胞瘤是中枢神经系统内最常见的原发性恶性肿瘤，具有发病率高、对放疗和化疗抵抗并容易复发等特点〔1〕。新的治疗方式例如中药联合肿瘤抑制基因治疗越来越被关注。Rab23属于小GTP 酶，是Ras致癌基因家族的一名成员，位于染色体 6p12.1，最早是1994年从小鼠脑部分离得到，Rab23基因在肝癌、胃癌等肿瘤的发生、发展中起到重要作用〔2〕。人参皂甙Rg3是人参二醇类四环三萜皂甙，具有显著的抗肿瘤作用〔3〕。本实验选取胶质瘤U251细胞为实验对象，探讨Rab23基因联合人参皂甙Rg3对U251细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1材料 细胞 胶质瘤细胞系U251，购自美国ATCC公司。试剂Rab23质粒，购自中国质粒载体细胞基因保藏中心；人参皂甙Rg3(纯度99%)，购自天津马克生物有限公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂购自美国Sigma公司；反转录试剂盒购自美国Invitrogen公司；仪器5417R台式高速离心机购自德国Ep-pendorf生命科学有限公司产品；JYH27020电泳仪购自美国 Bio-Rad公司产品；ELX800酶标仪购自美国Bio-Tek仪器有限公司产品。

1.2实验方法

1.2.1U251细胞培养与转染〔4〕将U251细胞培养至含10%胎牛血清、含100 U/L青链霉素的DMEM 培养基中，置于5%CO2、37℃恒温培养箱中，每隔1～2 d 用胰蛋白酶传代1次。将U251细胞以2.5×104个/ml的密度接种在铺有盖玻片的24孔板中。细胞80%融合后，按说明书操作转染细胞，质粒终浓度：25 mol/L。6 h后终止转染，用含10%小牛血清的 RPMI1640 培养液继续培养。

1.2.2分组与给药方法〔4〕将胶质瘤U251细胞分为4组，空白对照组，Rab23转染组，人参皂甙Rg3组和Rab23+人参皂甙Rg3组。Rab23转染组用脂质体转染Rab23质粒过表达Rab23。人参皂甙Rg3组给予25 mg/L人参皂甙Rg3处理，Rab23+人参皂甙Rg3组给予转染Rab23质粒和25 mg/L人参皂甙Rg3处理。

1.2.3Western印迹检测Rab23蛋白的表达〔5〕用RIPA细胞解液提取总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度，各取40 μg取蛋白行Western印迹检测。10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转膜印迹，经封闭液4℃作用过夜后，用鼠抗人Rab23抗体(稀释度为1∶1 000)或GAPDH抗体与膜上的抗原结合。用辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG二抗(1∶2 000)与其反应后室温孵育2 h，用电化学发光(ECL)试剂盒显色，经压片曝光后，显影定影。采用 Quantity One 软件分析目的Rab23蛋白/GAPDH的灰度值进行统计分析，进行扫描采图与分析。

1.2.4实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测Rab23mRNA的表达〔5〕根据Genebank的β-actin和Rab23的序列，利用Premier5.0软件设计可扩增的产物，引物序列：β-actin上游引物为5′-CCTGGGCATGGAGTCCTGTG-3′，下游引物为5′-TCTTCATTGTGCTGGGTGCC-3′，扩增序列长度为182 bp。Rab23上游引物为5′-AGGCACTGGCAAAAAGGTTA-3′，下游引物为5′-CGGAGTGACTTCCACCAGAT-3′，扩增序列长度为198 bp。转染后48 h收集各实验组细胞1×107个，按Trizol 试剂盒说明书提取总RNA，测定RNA浓度及纯度备用，合成cDNA按常规行RT-PCR，反应体系：SYBR Premix ExTaqTMⅡ(2×)12.5 μl，cDNA 模板2 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μl，dH2O 8.5 μl。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40个循环，末次循环72℃延伸10 min。重复实验3次。Rab23 mRNA相对含量测定：用凝聚胶成像分析系统对电泳条带进行灰度扫描并用Quantity One软件计算Rab23mRNA/β-actin的比值，从而得出Rab23 mRNA的相对含量。

1.2.5MTT比色法检测U251细胞增殖抑制水平〔2〕将空白对照组和Rab23转染组细胞按1×107个/ml的密度接种于96孔培养板上，体积100 μl/孔，每组设5个复孔。细胞80%融合后，分别向Rab23转染组，人参皂甙Rg3组和Rab23+人参皂甙Rg3组加入25 mg/L人参皂甙Rg3，细胞接种48 h后，取96孔板行MTT检测。每孔加MTT溶液20 μl，37℃避光培育，4 h弃孔内上清液，加入150 μl DMSO，振荡10 min，充分溶解结晶，酶标仪上490 nm波长下测其吸光度值(A)。

1.2.6Western印迹检测增殖细胞核抗原Ki-67(Ki-67)和B细胞淋巴瘤(Bcl)-2蛋白的表达〔6，7〕细胞分组同1.2.2。给药48 h后，按照文献方法检测U251细胞中Ki-67和Bcl-2蛋白的相对表达水平。

1.3统计学方法 采用SPSS16.0软件行单因素方差分析及t检验。

2 结 果

2.1U251细胞中Rab23 蛋白的表达 空白对照组(0.91±0.24)凝胶成像及分析系统对样本的条带灰度值与相尖β-antin条带灰度值比值明显低于Rab23转染组(1.23±0.17)，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。

图1 U251细胞中Rab23蛋白的表达

2.2U251细胞中Rab23 mRNA的表达 空白对照组Rab23 mRNA灰度比值(0.83±0.12)明显低于Rab23转染组(1.69±0.37，P<0.01)。

2.3各组U251细胞的增殖水平 空白对照组、Rab23转染组、人参皂甙Rg3组和Rab23+人参皂甙Rg3组在第48小时吸光度A490值分别为0.87±0.08，0.61±0.06，0.49±0.11，0.35±0.03。与空白对照组比较，Rab23转染组、人参皂甙Rg3组和Rab23+人参皂甙Rg3的增殖水平明显依次降低，组间差异均有统计学意义(P<0.01)，Rab23+人参皂甙Rg3组作用最为显著，表明Rab23基因联合人参皂甙Rg3对胶质瘤U251细胞的增殖水平有明显协同抑制作用。

2.4U251细胞中Ki-67和Bcl-2蛋白的表达 与空白对照组比较，Rab23转染组、人参皂甙Rg3组和Rab23+人参皂甙Rg3的Ki-67蛋白表达水平明显依次降低，组间差异均有统计学意义(P<0.01)，Rab23+人参皂甙Rg3组作用最为显著，Bcl-2蛋白表达亦有同样趋势，表明Rab23基因联合人参皂甙Rg3对胶质瘤U251细胞的Ki-67和Bcl-2表达水平有明显协同抑制作用，见表1。

表1 各组U251细胞Ki-67和Bcl-2蛋白表达

3 讨 论

胶质瘤治疗以手术为首选，但由于胶质瘤具有浸润生长的特性，与脑组织间无明显边界，难以全部切除。探索新的治疗方法抑制胶质瘤已经成为医学的研究热点。肿瘤抑制基因联合中药治疗将具有非常好的前景。

Rab23基因编码的蛋白是小GTP 酶超家族Rab家族成员，Rab23在成年小鼠的脑、乳腺、胃、精巢、卵巢等组织中也有表达，提示Rab23在成体组织器官功能的维持过程中起重要作用〔8〕。同时，Rab23还介导了细胞内小泡的运输及溶酶体的内吞作用〔9〕。Hedgehog信号转导通路是一个经典的控制胚胎发育的信号转导途径，主要由3种分泌型糖蛋白配体Shh、Ihh 和Dhh，两个跨膜蛋白受体Ptch1、Smo，3个核转录因子Gli1、Gli2、Gli3及下游的靶基因等组成。在Hedgehog信号通路中，多种基因已经被鉴定为原癌基因或肿瘤抑制基因。Rab23可以通过调控转录因子Gli2和Gli3的活性或改变Smo与Gli之间关键因子的亚细胞定位，抑制Hedgehog信号通路的激活。Rab23可能是Hedgehog信号通路的负调节分子并成为Hedgehog信号转导途径调控中具有抑制肿瘤的作用的一个新靶点〔8～10〕。人参皂苷Rg3是由人参中提取的天然活性成分，具有诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞侵袭和转移、逆转耐药，与化疗联合协同增效等显著的作用〔11，12〕。

增殖细胞核抗原Ki-67是细胞作为细胞周期中核抗原的决定簇，在细胞周期中处于活动期的细胞均可表达，在肿瘤细胞中广泛应用作为处于增殖状态的标志物〔13〕。Bcl-2能够抑制细胞凋亡，延长细胞寿命，属于抗凋亡基因〔14〕。

综上，Rab23基因联合人参皂甙Rg3对胶质瘤U251细胞有抑制增殖和促进凋亡作用，并且联合作用比单独使用效果更加明显。肿瘤增殖是肿瘤患者致死的最直接原因。肿瘤抑制基因和中药联合治疗可能发挥较好作用，这为胶质瘤的治疗提供了一个新的方向。