下调miR-4295靶向CDKN1A调控胶质瘤U251细胞增殖和侵袭

王小言 夏鹰 金虎 陈伟明 陈晓东 聂柳 郑忠涛

(海口市人民医院神经外科，海南 海口 570208)

胶质瘤是常见的恶性肿瘤，有易转移、易复发、恶性程度高等特点，单纯的手术治疗难以彻底根治胶质瘤，术后辅助放疗、化疗等是目前常见的胶质瘤治疗手段，基因治疗是近年来受到广泛关注的治疗途径，也是目前研究的热点〔1〕。miRNA不仅参与机体正常生长发育，调控细胞的生长、分化等过程，还与人类的多种疾病发生有关，例如心血管系统疾病、免疫系统疾病、神经系统疾病及肿瘤〔2,3〕。miR-4295是最近研究发现的与肿瘤有关的miRNA，在肺癌、膀胱癌等肿瘤中扮演促进作用，miR-4295能促进肿瘤细胞的生长和侵袭〔3～5〕。miR-4295在胶质瘤组织中过表达，并且其表达水平与患者的临床分期有关〔6〕。现阶段对miR-4295在胶质瘤中的作用尚不明确。本实验探讨下调miR-4295对胶质瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移能力的影响和靶向调控机制，为基因靶向治疗胶质瘤及明确miR-4295在肿瘤中的作用提供参考。

1 材料与方法

1.1材料 胶质瘤U251细胞购自美国ATCC；miR-4295 inhibitor、inhibitor control、miR-4295 mimics、mimics control均由上海吉玛制药技术有限公司构建；CDKN1A抗体购自生工生物工程(上海)股份有限公司；CDKN1A siRNA、siRNA control由上海吉凯基因化学技术公司构建；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen；荧光素酶报告载体由汉恒生物科技(上海)有限公司构建；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞转染及分组 胶质瘤U251细胞分为control组(未转染)、anti-NC组(转染inhibitor control)、anti-miR-4295组(转染miR-4295 inhibitor)，细胞转染操作步骤同Lipofectamine2000转染试剂。

1.2.2qRT-PCR检测下调效果 取培养48 h后的control组、anti-NC组、anti-miR-4295组细胞，添加Trizol试剂，分别提取细胞中的RNA，使用One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit进行逆转录反应，取cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq进行qRT-PCR，PCR条件分成两步，第1步为：95℃孵育30 s，第2步为：95℃孵育5 s，60℃孵育30 s，一共循环40次。利用Stepone Plus Realtime PCR System分析每个反应的Ct值，依照2-△△Ct方法计算miR-4295表达变化。引物序列为：miR-4295正义链5′-UCCCUCCCCAGUUCAUUGCACUU-3′，反义链5′-AAGUGCAAUGAACUGGGGAGGGA-3′。内参U6正义链5′-CTCGCTTCGGCAGCCACA-3′，反义链5′-AACGCTTCACGAATTGCGT-3′。

1.2.3四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定下调miR-4295后胶质瘤细胞增殖能力 将control组、anti-NC组、anti-miR-4295组细胞接种到96孔板，每个孔内加100 μl的细胞悬浮液(含有4×103个细胞)，培养48 h后，将培养板取出，添加10 μl的MTT工作液，放在37℃继续反应4 h。把孔内的上清溶液弃掉，依次添加二甲基亚砜(DMSO)溶液(每孔150 μl)，孵育反应10 min。测定酶标仪波长为490 nm的OD值。

1.2.4流式细胞术测定下调miR-4295后胶质瘤细胞凋亡水平 取control组、anti-NC组、anti-miR-4295组细胞，常规方法培养48 h，以胰蛋白酶消化成单细胞悬浮液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，最后将各组细胞悬浮在400 μl的结合缓冲液中，在细胞中添加PI及AnnexinV-FITC染色液(各5 μl)，充分混合后，立即用流式细胞仪测定各组细胞凋亡水平。

1.2.5Transwell小室测定下调miR-4295后胶质瘤细胞侵袭和迁移能力 取转染后的control组、anti-NC组、anti-miR-4295组细胞，按照每孔中添加8×104个细胞种植到8 μm的Transwell小室中，细胞培养液为不含血清的DMEM，同时在下室内补充600 μl的含有10%胎牛血清的DMEM。培养48 h后，用甲醇将迁移的细胞固定，使用棉签把没有迁移的细胞擦掉。用0.1%的结晶紫染色，在显微镜下随机选择5个视野分析计数迁移细胞数目。细胞侵袭实验步骤同迁移实验，在实验前用基质胶将小室湿化。

1.2.6靶基因预测和鉴定 利用在线靶基因预测软件分析miR-4295同CDKN1A的3′UTR端有结合位点，合成含有野生型(WT)和突变型(MUT)CDKN1A的3′UTR端寡聚核苷酸的荧光素酶报告载体(pmiRGLO)。使用Lipofectamine2000将miR-4295 mimics、mimics control分别同WT、MUT共转染到胶质瘤细胞中，在培养48 h后，使用荧光素酶测定试剂盒检测荧光素酶的活性。

1.2.7Western印迹检测下调miR-4295后胶质瘤细胞中CDKN1A蛋白表达 取control组、anti-NC组、anti-miR-4295组细胞，常规方法培养48 h，在细胞中加入含有苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA蛋白提取试剂，置于低温(4℃)中收集细胞，使用BCA法对蛋白浓度进行定量。采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。把收集的蛋白样品添加到1/4体积的5×上样缓冲液内均匀混合，然后放在沸水浴中反应5 min。在每个孔中添加30 μg蛋白样品，浓缩胶中以90 V电压电泳，分离胶中以120 V电压电泳，等到溴酚蓝已经到达凝胶底部之后关闭电源。把NC膜剪成合适大小，置于80 V、冰浴条件下电转膜45 min，用5%脱脂奶粉封闭后，同1∶1 200稀释的CDKN1A一抗结合反应2 h，再与1∶3 000稀释后的二抗结合2 h，最后用电化学发光(ECL)。根据条带的灰度值分析CDKN1A蛋白水平，内参为GAPDH。

1.2.8CDKN1A siRNA对下调miR-4295的胶质瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移影响 利用Lipofectamine 2000将miR-4295 inhibitor、CDKN1A siRNA共转染到胶质瘤细胞中，记为anti-miR-4295+si-CDKN1A组，同时将miR-4295 inhibitor、siRNA control共转染到胶质瘤细胞中，记为anti-miR-4295+si-NC组，转染后48 h，用Western印迹测定细胞中CDKN1A蛋白表达，MTT测定细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，Transwell小室测定细胞侵袭和迁移，步骤同上。

1.3统计学方法 采用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1miR-4295水平检测 胶质瘤细胞转染miR-4295抑制剂后，anti-miR-4295组miR-4295水平(0.45±0.03)显著低于control组(1.00±0.09)、anti-NC组(1.01±0.12，P<0.05)。表明miR-4295抑制剂抑制胶质瘤细胞中miR-4295表达。

2.2细胞增殖能力及凋亡率检测 胶质瘤细胞转染miR-4295抑制剂后，anti-miR-4295组细胞OD值均显著低于control组及anti-NC组 ，而凋亡率显著高于control组、anti-NC组(均P<0.05)。表明下调miR-4295抑制胶质瘤细胞增殖并诱导凋亡。见图1，表1。

图1 流式细胞术测定miR-4295抑制剂转染后胶质瘤细胞凋亡变化

表1 miR-4295抑制剂转染后胶质瘤细胞增殖和凋亡变化

2.3细胞侵袭和迁移能力检测 胶质瘤细胞转染miR-4295抑制剂后，anti-miR-4295组迁移和侵袭数目均显著低于control组及anti-NC组(均P<0.05),见表2。表明下调miR-4295抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭。

表2 miR-4295抑制剂转染后胶质瘤细胞侵袭和迁移能力变化个)

2.4生物信息学软件预测 miR-4295与CDKN1A的3′UTR端有互补结合位点，荧光素酶报告系统鉴定结果发现CDKN1A为miR-4295的靶基因，见图2。miR-4295 mimics组WT显著低于mimics control组(P<0.05)，见表3。表明miR-4295靶向调控CDKN1A。

图2 生物信息学软件预测miR-4295与CDKN1A的3′UTR端结合位点

表3 荧光素酶报告系统鉴定靶向关系

2.5CDKN1A蛋白检测 胶质瘤细胞转染 miR-4295抑制剂后，anti-miR-4295组CDKN1A蛋白水平(0.85±0.09)显著高于control组(0.51±0.06)及anti-NC组(0.49±0.06，均P<0.05),见图3。表明下调miR-4295促进胶质瘤细胞中CDKN1A蛋白表达。

图3 Western印迹检测miR-4295抑制剂转染后胶质瘤细胞中CDKN1A蛋白表达

2.6CDKN1A siRNA和miR-4295抑制剂转染后细胞活力及CDKN1A蛋白检测 anti-miR-4295+si-CDKN1A组CDKN1A蛋白水平、凋亡率显著低于anti-miR-4295+si-NC组，而细胞OD值、侵袭和迁移数目均显著高于antimiR-4295+si-NC组(均P<0.05)，见图4、图5、表4。表明CDKN1A siRNA逆转下调miR-4295对胶质瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响。

1～2：anti-miR-4295+si-NC组,anti-miR-4295+si-CDKN1A组图4 Western印迹检测CDKN1A siRNA和miR-4295抑制剂转染后的胶质瘤细胞中CDKN1A蛋白表达

图5 流式细胞术检测CDKN1A siRNA和miR-4295抑制剂转染后的胶质瘤细胞凋亡变化

3 讨 论

miRNA是一类在人体组织中广泛存在的非编码RNA，有很多生物学作用，在组织修复、细胞生长、胚胎发育等生理过程中扮演关键角色〔7〕。miRNA还与人类疾病的发生有关，其可通过调控心肌细胞、血管内皮细胞等多种细胞的生长、凋亡影响心血管系统疾病的发生，miRNA还与关节炎、糖尿病等疾病关〔8，9〕。miRNA异常表达与肿瘤细胞的生长、转移、凋亡有关，miRNA也是目前基因靶向治疗关注的热点〔10〕。本实验提示下调miR-4295有抵抗胶质瘤恶性生长的作用，靶向miR-4295可能是抑制胶质瘤进展的途径。miR-4295可促进鼻咽癌、胰腺导管癌等细胞的恶性增殖，miR-4295在肿瘤组织中高表达〔5,11,12〕。本实验提示miR-4295在胶质瘤进展中也扮演类似癌基因的作用。

肿瘤细胞的侵袭和迁移是肿瘤转移和浸润的基础，而肿瘤转移和浸润是肿瘤患者死亡的重要原因〔13,14〕。miR-4295参与调控肿瘤转移过程，在甲状腺未分化癌和膀胱癌等肿瘤中已经证实miR-4295有促进肿瘤细胞侵袭和迁移的作用〔5,11,12〕。本实验提示下调miR-4295能抵抗胶质瘤转移和浸润，miR-4295在胶质瘤转移中也可能扮演抑制作用。

miRNA参与多种病理及生理进程与靶向调控基因的表达有关，并且同一个miRNA在不同的组织或病理过程中可能同时有多个不同的靶基因〔15～17〕。目前对于miR-4295的研究显示，miR-4295作用机制与PTEN、BTG1等靶基因的表达有关〔4,5〕。本实验发现miR-4295能靶向负调控胶质瘤细胞中CDKN1A的表达。CDKN1A是一个与细胞生长有关的调节因子，其能降低细胞生长速度。CDKN1A与肿瘤发生有关，其在肿瘤进展中发挥抑癌基因的作用，CDKN1A过表达可抑制胶质瘤细胞的生长〔18～20〕。本实验结果提示下调CDKN1A可靶向负调控CDKN1A表达抑制胶质瘤细胞增殖、侵袭、迁移和诱导凋亡。

综上，miR-4295在胶质瘤进展和转移中可能发挥促进作用，靶向下调miR-4295表达可能是胶质瘤治疗的有效途径，下调miR-4295能够在体外降低胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力，并且可以诱导细胞凋亡发生，作用机制与靶向负调控CDKN1A的表达有关。miR-4295在胶质瘤发生和转移中的具体机制还需要在以后的实验中深入探讨。