中药萎胃康对慢性萎缩性胃炎大鼠wnt3α、wnt5α、β-catenin蛋白表达的影响

吕俊慧 于佳宁 陈露 宋汉娜 林海燕

(滨州医学院 1中西医结合学院，山东 烟台 264003；2烟台附属医院两腺外科)

慢性萎缩性胃炎(CAG)是一种常见的消化系统疾病，其特点是胃黏膜萎缩变化，内分泌腺减少或消失。其病程长，难以治愈，通常伴或不伴纤维替换性肠上皮化生和(或)假性幽门上皮化生〔1〕。临床症状是胃部饱胀感、胃痛、反酸、胃灼热，尤其饭后明显。长期反复发作，极易导致癌变，严重影响人们的生活质量。胃癌对于消化道黏膜的伤害是不可逆的，且易转移，其治疗过程艰难；但CAG是可逆的，确诊和治愈也更为简便。所以对于CAG癌前病变的研究尤为重要。目前，CAG的病机尚不清楚，亦没有疗效较好的药物。临床上西医主要是对症治疗，但是治标不治本。而中医药应用时间久，累积了丰富的案例经验，在临床中有独特的优势。目前，大多中医认为CAG的病机是本虚标实，本研究从脾胃虚证，瘀血阻络的方向出发，以益气养阴，活血通络法为主组方，对萎胃康进行研究。萎胃康对CAG有较好的治疗作用，且优于维酶素〔2〕。研究发现该药能有效改善CAG大鼠胃黏膜腺体萎缩，改善胃肠激素对胃功能的调节作用，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，以防止癌变〔3〕。本研究复制CAG大鼠模型，通过检测各组大鼠胃黏膜wnt3α、wnt5α及β-catenin的含量，探讨萎胃康颗粒治疗CAG的可能机制。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物健康，雄性，SD大鼠60只，体重(120±20)g，山东济南朋悦繁育有限公司提供。单位许可证编号：SYXK(鲁)20140007。药品与试剂萎胃康颗粒(西洋参、白术、白芍、延胡索、三七和熊胆等)由滨州医学院附属医院药剂科完成鉴定及制备。水杨酸钠(批号：20181107)购自北京Solarbio；维酶素片(批号：20170215)购自新乡恒久远药业有限公司；兔抗β-catenin(批号:00051773)购自美国proteintech公司；兔抗wnt3α(批号:9G122B)、兔抗wnt5α(批号:ZP480BP80)及兔Ig-G免疫组化试剂盒(批号:13G24C26G0922)均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2方法 动物造模、分组随机从60只雄性SD大鼠中抽取10只作为正常组，其他作为造模组。按照传统方式复制模型〔4〕：用2%的水杨酸钠溶液，2 ml/d灌胃，灌胃前后1 h禁食禁水，前3 w正常饮食，后3 w间日足量饮食，进行6 w。然后随机从正常组抽取2只，造模组抽取5只，肉眼观察，模型组比正常组大鼠相比，体型瘦小，毛色粗糙晦暗。HE染色，光镜下观察到胃黏膜腺体萎缩减少，排列松散，有炎性细胞浸润。确认造模成功后，将剩余45只模型大鼠随机分为萎胃康高〔3.00 g/(kg·d)〕、中〔1.50 g/(kg·d)〕、低〔0.75 g/(kg·d)〕剂量组、维酶素组〔0.3 g/(kg·d)〕、模型组，每组9只，模型组和正常组均灌生理盐水，1次/d，连续灌胃30 d。组织形态学观察30 d后，禁食24 h，腹腔注射10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)，麻醉后固定解剖，把整个胃取出，肉眼观察整个胃部的变化，然后顺着胃大弯剪开，用生理盐水冲洗。留取胃窦部，剪为合适的大小，用中性甲醛固定液(10%)固定12 h以上。流水冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋，然后以4 μm的厚度进行连续切片4张，1张做苏木素-伊红(HE)染色，其余3张用于免疫组化检测。指标检测采用免疫组化法(IHC)，严格按照wnt3α、wnt5α和β-catenin抗体试剂盒说明书进行实验，二氨基联苯胺(DAB)染色后抗体在组织中的表达呈黄褐色，在高倍镜下随机取5个视野拍照后，用Image-Pro Plus6.0图片分析软件测积分光密度(IOD)，5个视野的平均IOD即为该大鼠胃组织相应指标的测定值。

1.3统计学方法 应用SPSS20.0软件进行单因素方差分析及t检验。

2 结 果

2.1光镜下各组大鼠胃黏膜的病理变化 正常组胃黏膜腺体排列紧密有序，无或有少量炎性细胞。模型组胃黏膜变薄，腺体萎缩减少，排列松散，有炎性细胞浸润。萎胃康高剂量治疗30 d后，胃黏膜腺体萎缩情况缓解，排列稍微整齐，腺体数目增多，接近正常胃黏膜。见图1。

图1 各组大鼠胃黏膜病理情况(HE，×20)

2.2各组大鼠胃黏膜wnt3α、wnt5α和β-catenin的表达 与正常组比较，模型组wnt3α、wnt5α和β-catenin表达水平均显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)；与模型组比较，各给药组wnt3α、wnt5α和β-catenin表达均显著下降，差异均有统计学意义(均P<0.05)。说明萎胃康和维酶素都能降低胃黏膜wnt3α、wnt5α和β-catenin的蛋白表达量，且萎胃康高剂量组的治疗效果比其他给药组更显著(P<0.05)。见表1、图2～4。

图2 各组大鼠胃黏膜wnt3α蛋白的表达(DAB,×40)

图3 各组大鼠胃黏膜wnt5α蛋白的表达(DAB,×40)

图4 各组大鼠胃黏膜β-catenin蛋白的表达(DAB，×40)

3 讨 论

CAG属于中医学 “胃脘痛”“痞满”“嘈杂”等范畴。目前，大多数中医学者认为，CAG的病机为本虚标实，本虚是气阴两虚，标实是瘀血阻络，两者之间关系密切，气阴不足，动力不足，运化失常，则脾胃腐熟水谷的能力下降；推动无力，血流不畅，则形成血瘀；瘀血阻络，则气血通行不畅，运化失常，导致脾气胃气升降失司；两者互成因果，互相影响。有瘀血阻滞脾胃，气血不通畅，不通则痛，就出现胃脘痛；脾胃气行不畅，气机升降失常则痞满；胃气虚，阴液不足，胃失于濡养，则嘈杂。萎胃康颗粒由西洋参、白术、白芍、延胡索、三七和熊胆等药物组成，有补气健脾、养阴益胃、活血化瘀的作用。其中，西洋参是君药，能益气生津、滋养胃阴，具有促进免疫力的功能。白术补脾益气，具有增强免疫的作用，白芍滋阴，对细胞免疫功能有正向作用，能抑制急性炎症水肿，共为臣药。延胡索用于全身各部气滞血瘀，能行气活血，散瘀止痛，三七活血化瘀，熊胆清热利湿，三者是为佐使药；另外，延胡索还能起到抗溃疡的作用，三七具有抗炎的作用，熊胆能抑菌抗炎助消化。

CAG作为胃癌的癌前状态，其发展演变影响人们的健康和生活，CAG的研究对于降低胃癌的发生有重要意义。研究发现，wnt信号通路的异常激活在胃癌中是一个普遍事件〔5,6〕。wnt蛋白家族通常是激活是Wnt信号通路的启动因子〔7〕。经典的wnt信号通路主要与β-catenin有关：β-catenin是一种多功能的蛋白质，能够影响细胞的生存、凋亡。正常情况下，β-连环蛋白发生磷酸化，不会积聚在细胞内〔8〕。当wnt信号进入细胞将Dsh激活后，活化的Dsh就会抑制肿瘤抑制基因(APC)、轴蛋白(Axin)和糖原合成酶激酶3β形成的复合物活性，因此，β-连环蛋白不能被磷酸化降解，大量累积在细胞内，激活TCF/LEF并调节下游靶基因的表达〔9〕。由此可见，wnt信号通路的激活与β-连环蛋白在细胞质累积的量有关，β-连环蛋白是胃癌病变中一个重要的蛋白指标。wnt3α目前研究比较多，普遍认为它能够激活wnt经典信号通路。研究发现，wnt3α表达量的上调在激活wnt信号通路导致胃癌的发生起到重要的作用，wnt3α的高表达会导致β-catenin在细胞内的大量积累，从而激活下游靶基因〔10〕。说明wnt3α、β-catenin在胃癌wnt信号通路激活中起双重作用，甚至是叠加作用。蔡园园〔11〕用免疫组化法检测发现，在CAG癌前病变的发展过程中，wnt3α、β-catenin 的表达量随着疾病的发展而增加。wnt5α是非经典的wnt信号通路，几乎在全身各部的肿瘤中都能找到它的参与。穆标等〔12〕用免疫组化法研究发现，从浅表性胃炎、萎缩性胃炎、肠上皮化生和不典型增生到胃癌，wnt5α的表达量是一个上调的过程，表明wnt5α参加了胃癌的发生过程，是关键的致癌基因。研究发现，wnt5α具有双重作用，在不同的非经典信号通路下，wnt5α能够降低β-连环蛋白的积累，而在这个过程中，wnt5α的浓度并没有变化；并且wnt5α可以通过与wnt3a竞争性与相关受体结合，抑制信号通路激活；或者wnt5α直接激活相关蛋白，促进β-catenin的降解，从而抑制肿瘤的发生，当wnt5α与特定受体结合时，它可以稳定β-catenin，上调其表达，激活经典信号传导途径，促使癌症发生〔13〕。由此可见wnt5α的表达与肿瘤的类型、不同的信号通路以及与wnt5a结合的受体种类有关，并且三者之间关系复杂。