上海地区伊立替康药物代谢相关基因检测室间质量评价结果分析

张芃胤， 权 静， 王雪亮， 肖艳群， 鲍 芸

（上海市临床检验中心，上海 200126）

伊立替康为喜树碱的半合成衍生物，是一种无活性的前体药物，主要代谢部位为肝脏，是晚期大肠癌的一线治疗用药，也可用于患者术后的辅助化疗；对肺癌、乳腺癌、胰腺癌等也有一定疗效[1]。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1（Urdine Diphosphate glucuronosyltransferase 1 family polypeptide A1，UGT1A1）是伊立替康代谢过程的关键酶，它的表达及活性与患者的不良反应密切相关。目前，已发现该基因的113个不同突变体，这些突变体可造成UGT1A1活性升高或降低，甚至无活性或无正常的酶表型。从2005年起，美国要求药品标签上应注明推荐患者在服用伊立替康治疗前的UGT1A1*28基因型[2]，这样有助于判断不良反应发生率。日本将UGT1A1*6和UGT1A1*28列为推荐检测项目[3]。临床医生应尽可能获取患者UGT1A1基因型检测结果，并根据相应结果慎重考虑给药剂量，从而在最大程度减轻毒性的同时，使患者获得最佳疗效。

为了保证UGT1A1基因多态性检测结果的准确、可靠，必须要有严格的质量控制措施。上海市临床检验中心于2019年在上海地区开展伊立替康代谢相关基因室间质量评价（external quality assessment，EQA）活动，以评估实验室检测结果的准确性，分析临床检测中存在的问题，进一步提高该项目的检测质量。

1 材料和方法

1.1 数据来源

收集2019年上海市临床检验中心伊立替康代谢相关基因EQA参评实验室采用日常检测系统（仪器+试剂+方法）检测样本后，在规定时间内（自样本接收后1周之内）上报至上海市临床检验中心数据库的检测结果。

1.2 方法

1.2.1UGT1A1*6和UGT1A1*28位点基因检测EQA质评物的制备 （1）向上海市血液中心申请获得约2 0 份丙氨酸氨基转移酶阳性人全血样本（废弃用血）。采用QIAamp DNA Mini Kit（德国Qiagen公司）提取基因组DNA，采用NanoDrop One超微量紫外可见光分光光度计（美国ThermoFisher Scientific公司）进行浓度测定。以基因组DNA为模版，以5'-ACAAGTGAGCAGGCAGTACC-3'和5'-GTCCGTCAGCATGACATCAA-3'为引物进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），检测仪器为Eppendorf GSX1 PCR仪（美国Eppendorf公司）；PCR试剂为AmpliTaq Gold 360 Master Mix（美国ThermoFisher Scientific公司），AxyPrep PCR清洁试剂盒购自美国Axygen公司。扩增得到包含UGT1A1*6和UGT1A1*28位点上、下游约940 bp的DNA片段。PCR反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃60 s，35个循环；72 ℃ 7 min。PCR产物送生工生物工程（上海）有限公司进行测序；测序反应通用试剂盒（UGT1A1*6、UGT1A1*28）购自北京华夏时代基因科技发展有限公司。（2）将原始基因组DNA用TE缓冲液稀释定量为50 ng/μL的工作液，准备5种（包含UGT1A1*6和UGT1A1*28的野生型、突变型不同组合）能力验证物品的工作液，40 μL/支分装。

1.2.2UGT1A1*6和UGT1A1*28基因检测EQA质评物的评价 制备10个批号能力验证物品，采用等距随机抽样法分别从分装好的能力验证物品中随机抽取10个，在重复条件下检测2次，进行均匀性评价。在2次EQA分发样本的同时，选取1个批号能力验证物品进行同步稳定性检验，取样数量为3支，重复测定2次。

1.2.3 EQA计划的设计 伊立替康代谢相关基因检测EQA计划为1年2次，每次EQA样本盘含有5支样本，其中2支为UGT1A1*6野生型和UGT1A1*28突变杂合型，2支为UGT1A1*6突变杂合型和UGT1A1*28野生型，1支为UGT1A1*6野生型和UGT1A1*28野生型。将样本统一编号后，通过冷链运送至各参评实验室。要求参评实验室采用日常检测系统（仪器+试剂+方法）进行检测，并在规定时间内（自样本接收后1周之内）将检测结果上报至上海市临床检验中心数据库，超过规定时间，系统将不再接收数据。

1.2.4 结果评价 依据回报结果计算各参评实验室的得分情况，每项检测结果与预期相符得10分，总分≥80分判定为成绩合格。计算各样本的总体符合率和不同检测方法的整体符合率，统计错误的检测结果。

2 结果

2.1 EQA样本验证结果

采用Sanger测序法进行基因型检测，确定EQA样本相应靶值，结果见图1；样本盘构成及预期结果见表1。采用荧光分子杂交法进行基因型检测，评价EQA样本的均匀性和稳定性，检测结果与预期值的符合率均为100%，EQA样本具有良好的均匀性和同步稳定性。

图1 UGT1A1＊6和UGT1A1＊28野生型和突变杂合型Sanger测序图

2.2 UGT1A1*6和UGT1A1*28基因检测实验室总体回报情况

参加2019年2次伊立替康代谢相关基因EQA计划的实验室分为29家和31家，在规定时间内收到的有效回报结果分别为25份和22份。在第1次的EQA中，采用了A组（11家）和B组（14家）2套编号不同的样本。2次EQA中，荧光分子杂交法是实验室最常用的检测方法，所占比例分别为52.00%（13/25）和50.00%（11/22）；其次为Sanger测序法，所占比例分别为44.00%（11/25）和45.45%（10/22）；仅有1家实验室采用了二代测序的方法。见表1、表2。

表1 第1次伊立替康代谢相关基因检测EQA样本盘构成及检测符合率

表2 第2次伊立替康代谢相关基因检测EQA样本盘构成及检测符合率

2.3 各实验室检测能力评价

2019年上海地区伊立替康代谢相关基因2次EQA结果显示，近90%的临床实验室均取得了满分成绩，有2家实验室不合格。见表3。

表3 2019年上海地区伊立替康代谢相关基因EQA成绩及总体符合率

2.4 3种不同检测方法的结果比较

本研究将2次EQA中3种不同检测方法的检测效能进行了比较，荧光分子杂交和二代测序法的阴阳性样本符合率均为100.00%，而Sanger测序法与之相比存在一定差距。见表4。

表4 2019年上海地区伊立替康代谢相关基因EQA不同检测方法符合率 %（份/份）

3 讨论

在伊立替康的代谢过程中，血液和肠道中的活性代谢产物SN-38水平过高可导致人体出现2种最突出的剂量限制毒性：粒细胞减少和迟发性腹泻[5-7]。SN-38主要是通过位于肝脏的UGT1A1的催化作用而转变为无活性的SN-38G，再通过尿液、胆汁排出。《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南（试行）概要》[8]指出：与伊立替康代谢相关的基因型主要为UGT1A1*6和UGT1A1*28。UGT1A1*28基因启动子存在多态性，表达量随着TA重复序列的增加而下降，突变纯合子个体SN-38葡萄糖醛苷化活性仅为野生型纯合子的35%。UGT1A1*6（211G＞A）是亚洲东部人群中特有的突变等位基因[9]，突变频率约为13%。该等位基因可使UGT1A1的活性下降70%，增加了伊立替康毒性作用的发生风险，可使4级中性粒细胞减少症的发生率升高3倍[10-12]。

上海市临床检验中心2019年第1次区伊立替康代谢相关基因EQA计划采用了2套编号不同的样本（A组和B组），这一措施在一定程度上能防止串通，可更好地反映各参评实验室的真实水平。结果表明，大部分开展此项目的临床实验室成绩理想，但也有部分实验室与预期结果有一定的偏差。与预期结果不符的实验室均采用Sanger测序法检测，且均为实验室自建方法（laboratory developed test，LDT）。Sanger测序法一直被认为是临床基因分型检测的“金标准”[13]，操作步骤较多，出现差错的概率较高，而且测序结果需要人工判读，对检测人员的要求较高，需要加强检测位点相关知识的培训，完善相应的标准操作规程，并严格执行，避免误报。如UGT1A1*28的结果判读，需要统计TA重复的次数，TA6指A（TA）6TAA，TA7为A（TA）7TAA，很容易将不属于突变区域的TAA碱基序列误判为重复的TA序列，造成错误结果。此外，样本处理过程中产生的交叉污染，实验室环境中存在高浓度扩增产物污染，纯化不够彻底造成测序杂峰等，都是结果出现偏差的潜在原因。同时，实验室使用的LDT是否进行过性能验证，准确度、精密度、可报告范围、参考区间、分析灵敏度和特异性等参数是否能够满足临床需求，还需要进一步的临床验证[14]，这些都对临床实验室提出了更高的要求。随着国家相关政策的调整以及Sanger测序法技术门槛和成本的降低，使得只能在少数专业检测机构开展的项目逐步普及化，更加凸显了实验室各项质量控制措施的重要性。

伴随着个性化用药在临床中的广泛应用，通过检测UGT1A1*6和UGT1A1*28基因型，临床医生在使用伊立替康时剂量能够更加精确。上海市临床检验中心开展的伊立替康代谢相关基因EQA计划，全面评价了上海及周边地区临床实验室该项目的检测质量。希望通过EQA计划的开展和深入，帮助临床实验室及时发现日常工作中的问题，保证检测质量。