SDS 和SAP 前处理联合MALDI-TOF MS 在报阳血培养样本快速病原菌鉴定中的价值

余佳佳， 李媛睿， 刘 瑛

（上海交通大学医学院附属新华医院检验科，上海 200092）

血流感染是临床最主要的全身感染性疾病，严重威胁患者的生命安全；血流感染性休克引起低血压后，有效的治疗措施每延迟1 h，患者生存率降低7.6%[1]。血培养是血流感染诊断的金标准[2]，阳性血培养样本中病原菌的快速鉴定可为临床及时、有效的抗感染治疗提供重要依据[3]。按照传统临床微生物检测的流程，血培养报阳后需要16～24 h才能出具病原菌的鉴定结果，无法满足临床诊疗的需求。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）可用于阳性血培养样本的直接鉴定，根据对血培养样本前处理方法的不同可以分为试剂盒提取法[4]、血细胞裂解法[5]、差速离心法[6]和分离胶法[7]。其中，血细胞裂解法中使用的裂解试剂主要有十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）[8]和皂甙（saponin，SAP）[5]。本研究拟评估SDS和SAP前处理联合MALDI-TOF MS对阳性血培养样本进行快速鉴定的应用价值。

1 材料和方法

1.1 样本来源

收集2018年4月—2019年4月上海交通大学医学院附属新华医院阳性血培养样本296例。

1.2 仪器和试剂

BACTECTMFX血培养系统及配套血培养树脂需氧瓶和含溶血素厌氧瓶、MALDI-TOF MS仪及配套Microflex Biotyper3.0鉴定分析软件、96孔金属靶板、α-氰基-4-羟基肉桂酸（alphacyano-4-hydroxyc innamic acid，HCCA）基质（美国Bruker Daltonik公司）；电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；Centrifuge 5471R台式高速冷冻离心机和微量移液器（德国Eppendorf公司）。10% SDS（南通Beyotime公司）；SAP（南京酷尔生物公司）；甲酸、乙腈和三氟乙酸（美国Sigma-Aldrich公司）；血平板、麦康凯平板、革兰染液（上海伊华生物技术有限公司）；巧克力平板（上海科玛嘉微生物技术有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 阳性血培养样本的前处理和直接MALDITOF MS鉴定 抽取1 mL报阳血培养样本2份，分别置于1.5 mL Eppendorf管中，分别加入100 μL SDS和SAP溶液，上下颠倒混匀后，150×g离心10 min，弃上清液，每管均加入1 mL无菌水，吹打混匀后，150×g离心2 min，弃上清液，重复该步骤1次，最后每管再加入1 mL 75%乙醇，吹打混匀后，150×g离心2 min，弃上清液，在底物中加入适量甲酸和等量的乙腈，混匀后分别取1 μL点在金属靶板上，自然干燥后分别加1 μL HCCA基质，干燥后进行MALDI-TOF MS检测。通过Microflex软件获得质谱峰图，参数设计：质荷比（m/z）为2 000～20 000，shots为200，激光强度为80%，保存图谱。采用Biotyper 3.0软件比对质谱峰图，获得鉴定结果。

1.3.2 常规转种培养和MALDI-TOF MS鉴定 抽取适量报阳血培养血样本，分别接种于血平板、麦康凯平板、巧克力平板，涂片行革兰染色。将平板置于35 ℃孵箱中，孵育过夜后挑取单个菌落，点涂在金属靶板上，加1 μL甲酸，自然干燥后加1 μL HCCA基质，干燥后进行MALDI-TOF MS检测。

1.4 统计学方法

采用SPSS 2.0软件进行统计分析。计数资料以例或率表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血培养样本鉴定结果

296例阳性血培养样本中有272例分离出单数菌，24例分离出2种或2种以上病原菌。

与传统血培养转种培养后的菌落质谱鉴定结果比较，272例分离出单数菌的阳性血培养样本中，采用SDS前处理结合MALDI-TOF MS鉴定至种水平的有210例，种水平鉴定准确率为77.2%；鉴定至属水平的有226例，属水平鉴定准确率为83.1%。采用SAP前处理结合MALDITOF MS鉴定至种水平的有192例，种水平鉴定准确率为70.6%；鉴定至属水平的有206例，属水平鉴定准确率为75.7%。见表1。

表1 SDS和SAP联合MALDI-TOF MS对阳性血培养样本病原菌的鉴定结果 株

2.2 2种前处理方法鉴定准确率比较

2种前处理方法对272例阳性血培养样本的鉴定准确率在种水平上的差异无统计学意义（P=0.079），在属水平上的差异有统计学意义（P=0.034）。但SDS前处理法在葡萄球菌的鉴定上效果优于SAP前处理法（种水平P=0.009，属水平P＜0.001）；而SAP前处理法对非发酵菌的鉴定效果优于SDS前处理法（属水平P=0.048）。SDS前处理法和SAP前处理法鉴定念珠菌的效果均较好，其中SDS前处理法鉴定至种水平的准确率为72.7%。见表2。

表2 2种前处理方法MALDI-TOOF MS鉴定准确率比较 %

续表1 株

2.3 2种前处理方法鉴定分数比较

在属水平鉴定准确的菌株中，SDS前处理法鉴定分数＞2.0分79例，1.7～2.0分78例，＜1.7分69例；SAP前处理法鉴定分数＞2.0分38例，1.7～2.0分65例，＜1.7分103例。

2.4 复数菌血培养样本的鉴定结果

24例分离出2种或2种以上病原菌的血培养样本中，SDS前处理结合MALDI-TOF MS鉴定出其中1种病原菌至种水平的准确率为66.7%，其中有1例阳性血培养样本中2种病原菌均被鉴定至种水平；SAP前处理结合MALDI-TOF MS鉴定出其中1种细菌至种水平的准确率为58.3%。2种前处理方法鉴定准确率差异无统计学意义（P=0.551）。

3 讨论

血培养是诊断血流感染的金标准，对引起血流感染的病原菌进行快速鉴定至关重要，是临床经验性抗感染治疗重要的依据。对阳性血培养样本进行前处理后直接鉴定病原菌可以将鉴定时间提前16～24 h。本研究对296例阳性血培养样本进行快速鉴定，前处理方法采用细胞裂解法，以SDS和SAP作为裂解剂，可以快速破坏宿主的红细胞和白细胞，然后通过离心收集菌体，并进行鉴定。本研究272例分离出单数菌的阳性血培养样本中，采用SDS和SAP前处理联合MALDI-TOF MS的种水平鉴定准确率分别为77.2%和70.6%，差异无统计学意义（P=0.079）；属水平鉴定准确率分别为83.1%和75.7%，差异有统计学意义（P=0.034）。在属水平鉴定准确的菌株中，SDS前处理法联合MALDI-TOF MS的鉴定分数高于SAP前处理法，且在分离出复数菌的阳性血培养样本的鉴定中，可能是由于复数菌的例数较少，2种前处理方法鉴定准确率差异无统计学意义，但SDS法鉴定其中1种细菌至种水平的准确率略高于SAP法，且有1例血培养阳性样本2种细菌均鉴定至种水平。SDS前处理法对葡萄球菌的鉴定效果明显优于SAP法，但对非发酵菌的鉴定效果略差。综合分析发现，SDS前处理法的鉴定效果略优于SAP前处理法。

本实验室前期利用MALDI Sepsityper Kit和分离胶法收集阳性血培养样本中的菌体，进行MALDI-TOF MS鉴定，种水平鉴定准确率分别为72.5%和73.6%，属水平鉴定准确率分别为76.0%和77.3%，鉴定结果较SDS前处理法略差，但较SAP前处理法略好。其中试剂盒法鉴定葡萄球菌至种水平的准确率仅为77.4%，分离胶法鉴定念珠菌至种水平的准确率仅为19.4%，远低于SDS法[9-10]。MALDI Sepsityper Kit联合质谱鉴定的时间约为40 min，分离胶法联合质谱鉴定的时间约为20 min，SDS和SAP前处理法联合质谱鉴定的时间约为20 min。SDS前处理法联合质谱鉴定所需时间较少，而且鉴定准确率高，成本更低，操作更简单，适合在临床微生物实验室广泛开展。

本研究发现，SDS和SAP前处理法联合MALDI-TOF MS直接鉴定阳性血培养样本时，对肠杆菌科细菌的鉴定准确率最高，SDS前处理法种水平鉴定准确率超过90%，这可能与肠杆菌科细菌繁殖速度快，报阳时抽取1 mL血培养样本收集的菌量较多，而且肠杆菌科细菌的细胞壁较薄，容易被甲酸裂解释放核糖体蛋白有关，因此鉴定效果最佳。但这2种前处理方法对非发酵菌的鉴定效果均较差，特别是SDS前处理法联合质谱鉴定至种水平的准确率仅为53.2%，其中嗜麦芽窄食单胞菌的鉴定准确率最差，仅为16.7%，原因还有待研究，可能与细菌繁殖较慢，收集的菌量较少有关。SDS前处理法和SAP前处理法鉴定念珠菌至种水平的准确率分别为72.7%和63.6%，较肠杆菌科和葡萄球菌低，可能与念珠菌繁殖速度慢，1 mL血培养样本中收集的菌量少，且念珠菌的细胞壁较厚，甲酸裂解效果较差有关[11]。若发现阳性血培养样本涂片结果为真菌孢子，建议适当增加血培养样本的抽取量，然后加入SDS或SAP进行裂解，再离心富集细菌进行MALDI-TOF MS检测，从而提高鉴定准确率。

采用SDS和SAP前处理法联合MALDI-TOF MS对阳性血培养样本进行鉴定，操作简便，成本较低，可以快速、准确地得到初步鉴定结果；特别是SDS前处理法，鉴定效果优于SAP前处理法、分离胶法和商品化试剂盒，可以在临床微生物实验室广泛开展。对阳性血培养样本进行直接病原菌鉴定，可以快速、准确地向临床报告引起血流感染的菌种，为临床经验性抗感染治疗提供有效的依据。