支气管哮喘患儿白三烯B4 受体和2 型免疫相关标志物的表达及其临床意义

林鸿胜， 杨 丹， 龙巧波， 赵春妹， 邓廷茂

（1.海口市琼山区妇幼保健院儿科，海南 海口 571101；2.张掖市第二人民医院儿科，甘肃 张掖 534000；3.海口市琼山区妇幼保健院检验科，海南 海口 571101）

支气管哮喘是一种慢性呼吸系统疾病，其特征是气道高反应性、炎症引起的气道阻塞及气道重塑[1]。免疫细胞和其他炎性介质参与了哮喘的病理生理进程[2]。哮喘患者中大部分为儿童及青少年[3]。因此，通过各种临床和生物标志物预测儿童哮喘的发病及其严重程度是小儿呼吸学科的重要课题。在特应性体质人群中，过敏原暴露可促进辅助性T细胞2（T helper cell 2，Th2）细胞因子的激活，特别是白细胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5和IL-13等2型免疫相关因子，这提示2型免疫应答有可能是哮喘的发病机制之一[4]。另外，有研究结果显示，白三烯B4受体（leukotriene B4 receptor，LTB4R）在过敏性疾病，包括哮喘中发挥了重要作用[5]。为此，本研究拟探讨LTB4R及2型免疫相关标志物在支气管哮喘患儿中的表达及其临床意义。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2019年1月—2020年1月海口市琼山区妇幼保健院就诊的支气管哮喘患儿100例（哮喘组）作为训练集，其中男68例、女32例，年龄6～11岁。根据《儿童支气管哮喘诊断与防治指南（2016年版）》[6]将100例患儿分为轻症组（轻中度哮喘，70例）和重症组（重度及以上哮喘，30例）。选取同期海口市琼山区妇幼保健院喘息性支气管炎[7]患儿32例（喘支组），其中男17例、女15例，年龄6～10岁。另选取2020年2—11月海口市琼山区妇幼保健院就诊的支气管哮喘患儿78例（男48例、女30例，年龄7～12岁；轻症组55例、重症组23例）、喘息性支气管炎患儿21例（男11例、女10例，年龄7～11岁）作为测试集。支气管哮喘患儿纳入标准：（1）由2位儿科呼吸病专科医生独立进行评估，根据症状、体征及支气管激发或舒张试验确诊为支气管哮喘；（2）年龄6～12岁；（3）既往未接受抗哮喘治疗；（4）无其他急、慢性呼吸道疾病。排除标准：（1）存在急、慢性感染；（2）存在其他自身免疫性或免疫缺陷疾病；（3）使用过激素或其他影响免疫系统功能的药物。本研究经海口市琼山区妇幼保健院伦理委员会批准，所有患儿监护人均签署书面知情同意。

1.2 方法

1.2.1 样本收集 采集所有对象清晨空腹静脉血5 mL，其中2 mL分离血清，3 mL用于分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。

1.2.2 LTB4R检测 采用密度分离液（深圳达科为生物技术股份有限公司）分离PBMC，将佛波酯（终浓度20 μg/L）、离子毒素（终浓度为1 μmol/L）及莫能霉素（终浓度2 μmol/L）与单个核细胞悬液混匀制成1 mL悬液，置于培养箱中孵育6 h，收集细胞。LTB4R检测试剂盒（货号MA1-20232）购自美国ThermoFisher Scientific公司，采用MACSQuant流式细胞仪（德国美天旎生物技术公司）检测，严格按仪器和试剂盒说明书要求进行操作。每份样本重复检测3次，取平均值。

1.2.3 2型免疫相关标志物检测 采用酶联免疫吸附试验检测血清IL-4、IL-5及IL-13水平，试剂盒（货号分别为KAC1281、BMS278、BMS231-3）购自美国ThermoFisher Scientific公司，检测仪器为Multiskan FC 酶标仪（美国ThermoFisher Scientific公司）。每份样本重复检测3次，取平均值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 26.0及GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量数据以±s表示，2个组之间比较采用t检验。计数资料以例或率表示，组间比较采用χ2检验。采用二分类Logistic回归分析构建回归模型，采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评估各项指标鉴别诊断支气管哮喘的效能。采用STRING 11.0软件进行蛋白质互相作用（protein-protein interaction，PPI）网络分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 哮喘组与喘支组LTB4R阳性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的比较

哮喘组LTB4R阳性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平均高于喘支组（P＜0.01）。见表1。

表1 哮喘组与喘支组PBMC LTB4R阳性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的比较

2.2 LTB4R及IL-4、IL-5、IL-13鉴别诊断支气管哮喘的效能

ROC曲线分析结果显示，LTB4R、IL-4、IL-5、IL-13鉴别诊断支气管哮喘的曲线下面积（area under curve，AUC）分别为0.784、0.787、0.688、0.739。采用二分类Logistic回归分析构建4种标志物诊断支气管哮喘的风险评分模型：风险评分=14.61+0.74×LTB4R+0.86×IL-4+0.50×IL-5+0.99×IL-13。风险评分模型鉴别诊断支气管哮喘的AUC为0.926，最佳临界值为468.18，见表2、图1。在测试集中验证风险评分模型，鉴别诊断支气管哮喘的AUC[95%可信区间（confidence interval，CI）为0.856（0.758～0.955），敏感性、特异性及准确性分别为86.66%、73.14%及59.80%，见图2。

图1 LTB4R及IL-4、IL-5、IL-13诊断支气管哮喘的ROC曲线

图2 在测试集中风险评分模型诊断支气管哮喘的ROC曲线

表2 LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13诊断支气管哮喘的ROC曲线参数

2.3 不同病情支气管哮喘患儿LTB4R阳性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的比较

重症组LTB4R阳性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平均高于轻症组（P＜0.001），见表3。

表3 不同病情支气管哮喘患儿LTB4R阳性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平的比较

2.4 LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13鉴别诊断轻症与重症支气管哮喘的效能

R O C 曲线分析结果显示，LT B 4 R、IL-4、IL-5及IL-13鉴别诊断支气管哮喘的AUC分别为0.677、0.700、0.689、0.801。采用二分类Logistic回归分析构建4种标志物诊断支气管哮喘的风险评分模型：风险评分=-4.38+1.02×LTB4R+0.90×IL-4+0.12×IL-5+1.03×IL-13。风险评分模型鉴别诊断支气管哮喘的AUC为0.926，最佳临界值为643.61，见表4、图3。在测试集中验证风险评分模型的诊断效能，结果显示，AUC（95%CI）为0.842（0.764～0.921），敏感性、特异性、准确性分别为78.22%、71.63%、49.85%，见图4。

图3 LTB4R及IL-4、IL-5、IL-13鉴别诊断轻症与重症支气管哮喘的ROC曲线

图4 在测试集中风险评分模型鉴别诊断轻症与重症支气管哮喘的ROC曲线

表4 LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13鉴别诊断轻症与重症支气管哮喘的ROC曲线参数

2.5 LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13的PPI网络分析

PPI网络分析结果显示，LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13主要与信号转导及转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）3、血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）、IL-18、C-C基序趋化因子配体（C-C motif chemokine ligand 22，CCL）22、CCL2、IL-1B、CX趋化因子配体8（CX chemokine ligand 8，CXCL8）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、IL-6、白细胞介素5受体亚单位α（interleukin 5 receptor subunit alpha，IL-5RA）、IL-3、STAT5A、IL-2、GATA结合蛋白3（GATA binding protein 3，GATA3）、白细胞介素2受体（interleukin 2 receptor，IL-2R）、STAT6、IL-4R、白细胞介素13受体α1（interleukin 13 receptor alpha 1，IL-13RA1）、集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）2、白细胞介素13受体α2（interleukin 13 receptor alpha 2，IL-13RA2）之间存在相互作用。见图5。

图5 LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13的PPI网络分析

3 讨论

白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）在支气管哮喘的发病过程中发挥着多重作用。（1）LTB4可使受抗原刺激的肥大细胞产生活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），介导Th2细胞因子的合成；（2）LTB4可通过NADPH氧化酶（NADPH oxidase 1，Nox1）-ROS-核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）级联反应介导血管内皮生长因子的合成；（3）LTB4可介导内毒素诱导的Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）-髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MYD88）-LTB4-ROSNF-κB级联反应，产生Th2细胞因子，合成IL-13[8]。LTB4主要通过与其受体LTB4R的相互作用来介导其生物学功能[9]。2型免疫反应即细胞毒型变态反应，是支气管哮喘重要的发病机制，影响着哮喘的不同表型。根据哮喘发病及疾病进展过程中是否浸润2型免疫相关细胞及细胞因子，可将哮喘分为2型哮喘和非2型哮喘[10]。除IL-5外，参与2型免疫反应的细胞因子还包括IL-4、IL-13等细胞因子。目前，关于联合检测多个2型免疫反应相关标志物及LTB4R预测小儿支气管哮喘发病及病情严重程度的研究较少。为此，本研究探讨了LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13在支气管哮喘中的价值。

本研究结果显示，哮喘组PBMC LTB4R阳性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平均高于喘支组（P＜0.01）。尽管支气管哮喘与喘息性支气管炎在临床表现上极其相似，难以鉴别，但从病理生理机制来看，支气管哮喘主要涉及肥大细胞和嗜酸性粒细胞，是由超敏反应所致，主要由2型免疫反应介导，因此LTB4R及2型免疫反应相关标志物会升高；而喘息性支气管炎主要由呼吸道合胞病毒等慢性感染所致，主要涉及中性粒细胞及支气管黏膜上皮细胞，虽然也是由超敏反应所致，但主要由非特异性免疫反应介导，因此IgE水平通常不升高，亦不涉及2型免疫反应[11]。本研究ROC曲线分析结果显示，采用二分类Logistic回归分析构建的风险评分模型可有效提高相关指标对支气管哮喘的诊断效能（AUC为0.926）。本研究结果还显示，重症支气管哮喘患儿PBMC LTB4R阳性率及血清IL-4、IL-5、IL-13水平均高于轻症患儿（P＜0.001），构建的风险评分模型鉴别诊断重症支气管哮喘的敏感性、特异性及准确性分别为90.24%、65.42%及50.16%。

本研究针对LTB4R、IL-4、IL-5及IL-13的PPI网络分析结果显示，4项指标主要与STAT蛋白家族、CCL家族及其他IL家族之间存在相互作用。IL与哮喘的发生、发展的关系已明确，而特应性哮喘与高水平的Th2细胞相关，这些细胞的分化主要通过两面神激酶（janus kinase，JAK） -STAT信号传导途径进行，通过靶向STAT通路可缓解严重哮喘的发作[12]。CCL与哮喘患儿呼吸功能相关[13-14]。CCL2的高表达可促进支气管哮喘患儿巨噬细胞极化，从而促进疾病进展[15]。

本研究尚有一些不足之处：（1）本研究样本量较小，且为单中心研究；（2）哮喘的诊断主要依赖临床症状及体征，血液学指标仅作为辅助诊断指标。后续将进一步扩大样本量，并进行多中心研究，进一步提高多指标联合检测模型的实用性，以提高其临床应用价值。

综上所述，LTB4R及2型免疫相关标志物IL-4、IL-5、IL-13对儿童支气管哮喘的辅助诊断及病情判断有一定的价值。