金线风中5种生物碱含量测定及提取工艺研究

李淑雅,梁跃辉,覃晓敏,王立升

(广西大学 医学院， 广西 南宁 530004)

0 引言

金线风收载于广西民族药籍中，是防己科植物粉叶轮环藤的根或藤茎，又称百解藤、金锁匙及凉粉藤等。用于治疗风热感冒、咽喉肿痛、牙痛、气管炎、痢疾、尿道感染、风湿性关节痛等疾病[1]。周法兴等[2-3]对金线风成分进行了研究，发现金线风中主要含有轮环腾宁碱、左旋箭毒碱、轮环藤酚碱等生物碱以及d-栎醇、β-谷甾醇等化合物。药理研究表明木兰花碱、左旋箭毒碱、非洲防己碱、巴马亭红碱、掌叶防己碱具有广泛的药理活性，包括抗糖尿病、抗炎、神经精神治疗[4-5]、免疫调节、降血脂[6]、抗氧化、抗真菌、舒张血管[7- 8]等。金线风作为民族药应用已久，关于该药材的质量控制、药效研究及新产品开发等相关报道较少。本实验建立同时测定金线风药材中木兰花碱、左旋箭毒碱、非洲防己碱、巴马亭红碱及掌叶防己碱5种生物碱成分的高效液相色谱(HPLC)方法，同时采用超声微波提取工艺为金线风功能性产品的深入开发提供实验依据。

1 试验

1.1 仪器与材料

Agilent 1260 高效液相色谱仪;Welch Xtimate C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);JA5003电子分析天平(上海安亭电子仪器厂);HH-1数显恒温水浴锅(常州市朗越仪器制造有限公司);R-1001N旋转蒸发仪(武汉捷士达科技发展有限公司);XH-300UL电脑微波超声波紫外合成催化合成仪(北京祥鹄科技发展有限公司);ZK-82B干燥箱(上海博讯实业有限公司)。

木兰花碱(批号：DST191114-004);左旋箭毒碱(批号：DST200425-116);非洲防己碱(批号：DST190528-009);巴马亭红碱(批号：DST190914-109);掌叶防己碱(批号：DST190919-047)对照品均购自成都德思特生物技术有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯试剂；磷酸、无水乙醇为分析纯；水为哇哈哈纯净水；去离子水为广西大学化学化工学院自制；金线风购自广西金秀。

1.2 试验方法与结果

1.2.1 对照品溶液制备

分别称取木兰花碱7.52 mg、左旋箭毒碱6.96 mg、非洲防己碱0.75 mg、巴马亭红碱1.53 mg、掌叶防己碱2.10 mg，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度分别为752.00、696.00、75.00、153.00、210.0 μg/mL的混合对照品储备液。

1.2.2 供试品溶液的制备

精密称定金线风根粉末(过80目筛)3 g，用60%乙醇48 mL 浸置30 min后，放置超声波提取器中，超声功率200 W，温度80 ℃，提取时间30 min，用纱布和滤纸抽滤，收集滤液，将滤渣重新放回圆底烧瓶，置于超声提取器中，重复提取3次，合并4次所得滤液，蒸干溶剂得其浸膏。取微量浸膏于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

1.2.3 色谱条件与谱图

色谱柱为Welch Xtimate C18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm);流动相为乙腈(A)-0.5%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱：0～10 min，5%→10%(A)；10～60 min，10%→18%(A)； 60～70 min，18%→25%(A)；70～85 min，25%→30%(A)；85～100 min, 30%(A)。检测波长为282 nm，进样量为5 μL，流速为0.5 mL/min，柱温30 ℃。对照品及供试品的色谱图如图1所示。

(a) 对照品

(b) 供试品

1.3 方法学考察

1.3.1 线性关系

分别精密吸取混合对照品溶液，稀释成6组不同质量浓度的系列混合对照品，见表1。分别按照1.1节的色谱条件进行测定，以各物质浓度(X，μg/mL)为横坐标，外标法测得峰面积(Y，mAU×S)为纵坐标，分别绘制标准曲线，并进行线性回归分析，结果见表2。5种对照品在相应的线性范围内具有良好的线性关系。

表1 对照品溶液浓度Tab.1 Concentration of reference substance 单位： μg/mL

表2 5种化合物的回归方程、相关系数R2、线性范围Tab.2 Regression equations, correlation coefficients R2, linear ranges of 5 components

1.3.2 精密度实验

取混合对照品溶液，按1.1节的色谱条件连续进样6次，记录峰面积。计算结果显示木兰花碱、左旋箭毒碱、非洲防己碱、巴马亭红碱、掌叶防己碱峰面积的RSD分别为1.40%、1.57%、1.01%、1.45%、1.74%，表明高效液相色谱仪精密度良好。

1.3.3 重复性实验

精密称取金线风粉末6份，按1.3节制备供试品进行测定，得到相应的峰面积并计算含量。计算结果显示木兰花碱、左旋箭毒碱、非洲防己碱、巴马亭红碱、掌叶防己碱峰面积的RSD分别为1.49%、1.78%、1.87%、1.14%、1.52%，结果显示该方法重复性良好。

1.3.4 稳定性实验

取同一金线风供试品，按1.3节的方法制备供试品溶液，以1.1节的方法分别于0、4、8、12、24、48 h进行测定，计算得到木兰花碱、左旋箭毒碱、非洲防己碱、巴马亭红碱、掌叶防己碱峰面积的RSD分别为0.99%、1.75%、1.74%、1.46%、1.33%，结果显示供试品溶液在48 h内稳定性良好。

1.3.5 加样回收率实验

精密称取已知含量的金线风6份，1.0 g，分别加入适量对照品溶液，按1.3节的方法制备供试品溶液，按1.1节的色谱条件测定。计算得到木兰花碱、左旋箭毒碱、非洲防己碱、巴马亭红碱、掌叶防己碱的平均加样回收率分别为99.86%、100.49%、100.26%、99.02%和102.02%，RSD分别为1.48%、1.50%、1.63%、1.53%、0.78%。结果显示该方法准确度良好，见表3。

表3 5种成分加样回收率Tab.3 Recoveries of the 5 detected components (n=6)

1.4 样品测定

精密称取批号为20200728、20200810、20200819的金线风，按1.3节的方法制备供试品溶液，按1.1节的色谱条件进行测定并计算木兰花碱、左旋箭毒碱、非洲防己碱、巴马亭红碱、掌叶防己碱的含量，结果见表4。

1.5 超声微波提取工艺优化

在单因素实验的基础上，采用正交法筛选出对金线风提取率影响较大的四个因素：提取液pH、乙醇浓度、料液比和提取次数，以金线风的生物碱提取率作为考察标准，采用四因素三水平对超声微波辅助的提取条件进行优化，即L9(34)，见表5。平行测量3次，每组实验的提取率取平均值。正交实验设计及结果见表6。

表4 金线风中5种化合物含量Tab.4 Content of five compounds in Cyclea hypoglauca (Schauer) Diels

表5 生物碱提取工艺的因素水平Tab.5 Factors and levels of extraction of alkaloid process

表6 正交实验结果Tab.6 Result of orthogonal experiment

分析表6中的极差值R可知，金线风生物碱提取率受各因素的影响程度不同，A最大，C最小，A>B>D>C，因此提取液的pH是影响金线风生物碱提取率的主要因素，其次为乙醇浓度和提取次数，料液比对金线风生物碱提取率的影响最低，由正交实验结果可得最佳实验条件为A1B2C2D3，即提取液pH为2，乙醇浓度为60%，料液比1∶18，提取4次。

1.6 最佳提取工艺验证实验

精密称取金线风中粉10 g于烧杯中，加入60%乙醇180 mL，用盐酸溶液调节提取液pH为2，提取时间1 h，实验结束后，用纱布和滤纸抽滤，收集滤液，将滤渣重新放回圆底烧瓶，置于超声波提取器中，重复提取4次，合并所得滤液，减压浓缩做成浸膏。测定金线风生物碱提取率，实验重复3次，结果见表7。根据实验结果数据，该提取工艺稳定，具有良好的重现性。

表7 验证实验结果Tab.7 Result of verification test

2 结论与讨论

用紫外分光光度计对左旋箭毒碱、非洲防己碱、木兰花碱、掌叶防己碱、巴马亭红碱这5种生物碱对照品的混合溶液进行紫外全波长扫描，发现在波长207、230、276、282 nm处均有较大吸收。采用高效分析液相色谱仪对这几个波长进行分析验证，选出最佳波长。结果显示，液相色谱图在282 nm处5种生物碱成分出峰信息全，峰型尖锐且基线平稳，并且每个成分的出峰都能得到很好的响应值，因此选择282 nm作为检测波长进行测定。

超声微波提取法提取率高于常规提取法主要是因为声波可以在环境中产生一系列连续的收缩和膨胀(海绵效应)。这种机械机制产生的力可能高于表面张力，表面张力将溶剂保留在组织的毛细管内，从而使得更多的生物碱在药材中产生微小的通道溶出[9]。超声波在含有生物碱的植物种扩散，由于空化现象，使得生物碱的提取变得容易。当空腔在细胞表面塌陷时，细胞壁被撞击破坏，从而提高了生物碱的提取率。微波辅助萃取是利用不同物质对微波能的吸收程度不同，对体系中不同成分进行选择性加热，从而使有效成分从植物种溶出，从而增加提取率。因此本实验选择超声微波提取法。

本实验建立了同时测定金线风提取物中木兰花碱、左旋箭毒碱、非洲防己碱、巴马亭红碱和掌叶防己碱含量的HPLC法，该方法灵敏快捷，准确可靠，重复性高，可为金线风提取物生物碱的质量评价与控制提供实验依据。同时生物碱提取工艺为金线风的进一步开发利用建立基础。