酸-醇体系丝素蛋白水凝胶制备与性能表征

刘 浩， 路明磊， 黄晓卫,2， 王 娜,2， 王雪芳,2， 宁 新， 明津法,

(1. 青岛大学 纺织服装学院， 山东 青岛 266071； 2. 青岛大学 非织造材料与产业用纺织品创新研究院，山东 青岛 266071； 3. 山东省特型非织造材料工程研究中心， 山东 青岛 266071)

水凝胶是一种集吸水、保水、缓释为一体的功能高分子材料，本质上类似于细胞外基质[1]，信号可以在其中传递、响应。目前，天然聚合物以其独特的生物特性已广泛应用于水凝胶的制备，其中丝素蛋白(SF)作为一种典型材料活跃于组织工程[2]、生物矿化[3-4]、智能[5-6]等领域。

SF是一种天然高分子材料，具有良好的生物相容性和可降解性[7-8]，在一定程度上表现为动力学稳定性和热力学不稳定性[9]。在水溶液中，SF分子在亲疏水作用下往往自组装成纳米微球，从动力学角度来看，纳米微球在无时无刻做着剧烈的布朗运动，由于中性条件下带有负电的SF分子微球间存在着静电斥力，阻碍了微球的进一步凝聚，在一定时间内溶液处于稳定状态[10]；但长时间的静置或在温度、pH值、极性溶液等外界因素的干扰下[11]，这种热力学稳定状态最终会因疏水、氢键、静电等非共价键作用而被破坏，实现物理交联，导致微球的凝聚和析出，最终形成一种相对稳定的凝胶网络结构[12-13]，这种凝胶过程往往伴随着SF分子由无规卷曲向β-折叠构象的转变[14]。在酸性条件下，SF分子间的静电斥力减弱，无电荷羧基的疏水性增强，引发了较强的链间集聚[12,15]。针对SF的这一特点，逐渐延伸出了多种凝胶工艺，如常规酸滴定法[16]、挥发性电解质诱导法(如高压二氧化碳诱导[17])、电场诱导法[18]等。其中，挥发性电解质诱导法是一种比较新的凝胶方法，较常规酸滴定法具有明显的优势，避免过多酸的残留对SF水凝胶结构造成二次破坏；同时，在密闭容器中酸的挥发会引起压强的变化，有利于SF溶液缓慢而均匀的酸化，促使SF溶液凝胶自上而下渐进式进行，使结构具有一定的取向性。

因材料自身因素影响，常见的SF水凝胶往往表现出力学性能差，凝胶成形困难等问题，且很大程度上仍然依赖于添加合适的材料来满足设计需要[19]，随着合成高分子聚合物的广泛应用，为水凝胶性能的可控性和可复制性提供了支持[20-21]。如通过添加表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)获得的SF水凝胶具有良好的力学性能，其压缩模量最高可达到3.0 MPa[22]；此外，将SF与聚丙烯酰胺组合，其压缩强度可达到122 MPa(应变为92%时)[23]。然而过多合成材料的引入不可避免会对SF的结构与生物性能产生一系列影响，限制其在生物医药等领域的进一步应用，因此，引入具有相容性、无毒性的材料和对SF进行物理加工是当前提高丝素蛋白水凝胶性能的常见方法[24]。为改善SF水凝胶的力学性能和提高凝胶速率，本文提出了一种乙酸-乙醇体系共同促进SF凝胶的方法制备结构均匀、形貌可控的纤维结构SF水凝胶，探索了水凝胶内部纤维结构的成形条件以及不同形貌下水凝胶的结构与性能差异，并测试分析了不同质量分数乙醇辅助诱导下获得SF水凝胶的聚集态结构变化，对其力学性能进行表征，以期为细胞或晶体材料提供一个稳定的生长空间，拓宽其在医学、电子等领域的应用。

1 实验部分

1.1 实验材料与仪器

材料：桑蚕丝，产自山东省；无水碳酸钠、无水氯化钙、无水乙醇、乙酸(冰醋酸)、己烷，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；透析袋，相对分子质量为3 500，上海雷布斯生物科技有限公司；去离子水，实验室自制。

仪器：S4800扫描电子显微镜(SEM)，日本日立公司；Nicolet5700 傅里叶红外光谱仪(FT-IR)， 美国赛默飞世尔科技公司；Ultima IV 系列X射线衍射仪(XRD)，日本理学株式会社；in Via 共聚焦显微镜拉曼光谱仪，英国雷尼绍公司；TGA/DSC3+LF同步热分析仪，瑞士梅特勒-托利多公司；Instron 3382双立柱落地式电子万能材料试验机，美国英斯特朗公司；HJ-6多头磁力搅拌器、HD101a-3电热鼓风干燥箱，青岛创合盛科教仪器设备有限公司；FD-1A-50冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；VPK-1-10T优普系列小型超纯水机，四川优普超纯科技有限公司。

1.2 可控形貌SF水凝胶的制备

根据文献[25-26]中的方法对蚕丝进行脱胶处理。首先，将蚕丝按照1∶50的浴比放入0.05%碳酸钠溶液中煮沸处理30 min，取出后用蒸馏水反复清洗，重复上述操作3次后烘干。然后，将已脱胶的蚕丝(8%)置于氯化钙-乙醇-水(量比为1∶2∶8)三元溶液中，在60 ℃下搅拌至完全溶解[27]。冷却至室温后，将上述液体转移到相对分子质量为3 500的透析袋中，在流动的去离子水中透析72 h，经过脱脂棉过滤后即得到3.0%的SF溶液。

取2 g乙酸于120 mm玻璃干燥器底部，静置一段时间至乙酸气体均匀分布，再另取10 g上述SF溶液倒入直径为35 mm的培养皿中，快速放于干燥器的隔板上，静置12～14 h即得到SF水凝胶。乙醇能够剥夺与SF相结合的水分子，促使SF分子链的重新组合，形成密集的氢键作用[28-30]，缩短凝胶时间。故本文向SF中缓慢加入无水乙醇，其质量分数分别为1.0%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%，混合均匀后置于乙酸环境中，1 h左右即可获得具有不同形貌的SF水凝胶。如果乙醇质量分数过高，冻干后的样品将无法成形，实验参数如表1所示。

表1 丝素蛋白水凝胶实验参数Tab.1 Specification parameters of silk fibroin hydrogels

1.3 性能测试与表征

1.3.1 水凝胶形貌观察及直径测试

将冻干后的SF水凝胶切片后用导电胶贴在工作台上，喷金处理60 s。采用背散射模式、标准束流，通过扫描电子显微镜观察样品形貌，加速电压为10 kV。然后将样品的扫描电镜照片导入Nano Measurer 1.2软件中，随机选取50根纤维进行直径测量，计算水凝胶内部纤维直径的平均值及偏差。

1.3.2 水凝胶聚集态结构测试

取适量冻干后的水凝胶样品于研钵中，加入溴化钾研磨均匀，压片并在傅里叶红外光谱仪中进行测试。仪器的分辨率为4 cm-1，扫描32次，检测范围为4 000～400 cm-1。谱图的采集和分析均使用Thermo Fisher公司的OMNIC 8.0软件，并将获得的数据导入到Origin中进行绘制。此外，选取1 700～1 600 cm-1波数范围内的红外光谱图导入PeakFit v4.12软件，采用傅里叶自去卷积法对酰胺I带进行分峰拟合，得到各二级结构子峰的分布和强度，并通过计算各子峰的积分面积即可得到SF水凝胶内部各聚集态结构的相对百分比含量，从而分析乙酸-乙醇体系对SF聚集态结构的影响[31-33]。设置的拟合峰类型为高斯/洛伦兹型，带宽为50 cm-1，增强因子为3.0。

利用X射线衍射仪对水凝胶内部的结晶结构进行测试，衍射角范围为5°～45°，扫描速度为2 (°)/min，管电流为40 mA，管电压为40 kV，CuKα靶(波长λ=0.154 18 nm)。此外，通过拉曼光谱仪在2 000～500 cm-1范围内进行扫描，进一步验证水凝胶内部聚集态结构变化情况，测试激发波长为632.8 nm。

1.3.3 水凝胶热稳定性能测试

取3～4 mg SF水凝胶样品于40 mL铝干锅中，通过同步热分析仪获得不同样品的热稳定性能。温度范围为25～400 ℃，升温速度为10 ℃/min。样品始终处于氮气氛围中，流速为50 mL/min。

1.3.4 水凝胶孔隙率与吸水率测试

将不同乙醇质量分数的SF水凝胶制成直径为14 mm、高为10 mm的圆柱体，冻干后记录其干态质量为m0(mg)；然后将样品浸泡在去离子水中，水浴加热使温度保持在37 ℃，2 h后取出样品并用滤纸吸去样品表面残留的水珠，记录此时样品的湿态质量m1(mg)。每种样品重复5次测试取平均值。吸水率(Rmc)根据下式[34]进行计算：

SF水凝胶的孔隙率采用液体置换法进行计算[35]。室温下将上述样品浸泡在装有已知体积的己烷(V0(mL))的量筒中，记录当前样品和液体的总体积为V1(mL)；5 min后取出样品，量筒中剩余己烷体积为V2(mL)，则样品的孔隙率(E)通过下式计算得到：

1.3.5 水凝胶压缩性能测试

使用24孔板将SF水凝胶制成直径为14 mm、高为15 mm的圆柱体。在标准大气环境下通过电子万能材料试验机分别检测SF水凝胶样品在干态和湿态下的压缩性能以及韧性。在干态测试中，仪器的压缩速率为10 mm/min，将冻干的水凝胶样品压缩至自身形变的60%[36]；在湿态测试中，先将样品于磷酸盐缓冲液(PBS)中浸润，取出后在60%的压缩应变下进行5次循环压缩-释放，得到循环应力与应变关系曲线。每种样品重复5组测试，取平均值分析水凝胶样品在循环过程中的应力变化情况和回复性能。

2 结果与讨论

2.1 SF水凝胶的形貌分析

乙酸气体在密闭容器中的挥发缓慢改变着溶液pH值，丝素蛋白溶液受pH值梯度的影响自上而下缓慢凝胶，使结构取向延伸；同时乙醇质量分数的调节辅助诱导SF构象向β-折叠构象转变，加快凝胶速率。图1为在乙酸氛围下，不同质量分数乙醇诱导SF水凝胶样品的扫描电镜照片。可以看出，随着乙醇质量分数的增加，水凝胶内部结构发生明显变化，纤维化越趋明显，但如果乙醇的质量分数超过10.0%达到20.0%时，水凝胶冻干后将无法保持稳定的立体骨架结构。当SF溶液中不含乙醇(SF-0)时，水凝胶内部均匀分布着尺寸在几十到几百微米的孔洞，孔壁较为光滑，厚度为(4.36±2.61)μm。随着乙醇质量分数的增加，水凝胶内部结构向纤维化转变，先是孔壁变得粗糙，由纤维堆砌而成，随后纤维逐渐分离，交织成三维立体网络结构。当乙醇质量分数达到5.0%(SF-5)时，纤维直径为(1.09±0.5) μm，远小于Floren等[17]通过高压二氧化碳作为挥发性酸制备的纤维结构水凝胶(当质量分数在2.0%～4.0%时，直径为(2.22±0.5)～(5.62±1.4) μm， 压缩模量为(39.70±3.24)～(63.98±2.97) kPa)。 当乙醇的质量分数增大到10.0%时，纤维直径增大到(1.53±0.73) μm，纤维上串联的微球也愈发明显。这种纤维结构具有较大的比表面积，为细胞生长或生物矿化提供了良好的粘附、生长空间，同时也影响着水凝胶的内在性能。

图1 不同质量分数乙醇诱导丝素蛋白水凝胶的扫描电镜照片Fig.1 SEM images of SF hydrogels with different mass ratios of alcohol

2.2 SF水凝胶的聚集态结构分析

分别采用红外光谱、拉曼、X射线衍射法分析SF水凝胶的聚集态结构变化。图2示出不同质量分数乙醇诱导获得SF水凝胶的拉曼光谱图。拉曼曲线显示所有样品均在1 669、1 230、1 085 cm-1处出现明显的特征峰，代表着β-折叠构象，其余聚集态结构的特征峰均不明显。

图2 不同质量分数乙醇诱导SF水凝胶的拉曼光谱图Fig.2 Raman pattern of SF hydrogels with different mass fraction of alcohol

图3(a)示出不同乙醇质量分数下水凝胶样品的红外光谱图。可以看出，当乙醇质量分数为0%时，SF水凝胶的红外特征峰主要集中在1 653 cm-1(无规卷曲)、1 625 cm-1(β-折叠)、1 525 cm-1(β-折叠)、1 234 cm-1(无规卷曲)处。结合图3(c)SF水凝胶各二级结构合量变化发现，在不含乙醇条件下制备的丝素蛋白水凝胶内部以β-折叠构象为主，但无规卷曲构象所占比例仍然比较大。随着乙醇质量分数的增加，1 653 cm-1处特征峰的中心逐渐向低波数位移；而1 625 cm-1(低波数β-折叠)处特征峰的强度逐渐变强，整体峰宽度逐渐变窄，相对集中在1 640～1 620 cm-1之间。此外，1 701 cm-1处峰强轻微下降并向低波数转移，虽然没有明显偏移至1 698 cm-1(高波数β-折叠)，但峰型的改变也代表着SF聚集态结构发生了转变。

图3(b)示出乙醇质量分数为5.0%的水凝胶分峰图谱，拟合曲线的相似度达到0.999以上。将酰胺I带(1 700～1 600 cm-1)细分为10个子峰，通过各子峰的面积分析出聚集态结构在各阶段所占比例[37]，如图3(c)所示。可知，随着乙醇质量分数的增大，β-折叠构象含量显著提高，从最初的45.1%提高至50.5%左右，同时无规卷曲构象从22.3%下降到12.8%附近；当乙醇质量分数超过2.5%时，2种构象含量变化均趋于平缓；此外α-螺旋构象的含量也有了小幅度提高。上述结果可以发现，虽然乙酸也能促进丝素蛋白分子链转变成β-折叠结构，但含量较低；相较来说，乙醇能够快速促使水凝胶内部分子排列更加紧密，构象更加规整，β-折叠构象的含量也大幅度提高[28]。

图3 不同质量分数乙醇诱导SF水凝胶的二级结构Fig.3 Secondary structure of SF hydrogels with different mass fraction of alcohol.(a)FT-IR spectra of SF hydrogels；(b)FT-IR peak fitting curve of SF-5 hydrogel in amide Ⅰ region；(c)Change of secondary structure of SF hydrogel in amide Ⅰ region

图4示出不同质量分数乙醇诱导下获得SF水凝胶的XRD谱图。可以看出，所有样品均在20.8°附近有1个显著的特征衍射峰，为典型的silk II结构。此外，在9.1°和28.2°处均出现有特征衍射峰，代表着silk II结构，20.1°和24.5°处为silk I结构特征峰[1]。上述结果可知，随着乙醇质量分数的增加，20.1°处的特征峰逐渐消失，这与红外光谱、Raman结果较为吻合。综上，经乙醇处理的水凝胶具有更为显著的β-折叠构象特征，且结晶度显著高于仅受乙酸诱导的水凝胶，这使分子具有更高的取向，分子间作用力显著增强，对水凝胶的热稳定性与力学性能均会产生一定影响。

图4 不同质量分数乙醇诱导丝素蛋白水凝胶的X射线衍射光谱图Fig.4 XRD pattern of SF hydrogels with different mass fraction of alcohol

2.3 SF水凝胶的热稳定性能分析

图5(a)示出不同质量分数乙醇诱导SF水凝胶的DSC曲线。

图5 不同质量分数乙醇诱导丝素蛋白水凝胶的DSC和TG曲线Fig.5 DSC (a) and TG (b) curves of SF hydrogels prepared by different mass ratios of alcohol

结果表明，所有样品均有2处明显吸热峰：一处在60～130 ℃之间，代表水凝胶内部残留的自由水和结合水的蒸发；另一处吸热峰在294 ℃附近，为丝素蛋白的分解峰，此时分解速率达到最大，丝素蛋白间侧链和主链遭到破坏。有报道[28,38]显示，由于丝素蛋白内的部分无规卷曲和α-螺旋结构会随温度升高而转变成更加稳定的β-折叠结构，从而释放热量。实验发现在丝素蛋白分解前没有出现明显的放热峰，说明此时水凝胶样品内部以β-折叠结构为主。图5(b)示出不同质量分数乙醇诱导SF水凝胶的TGA曲线。可以看出，所有样品也均存在2个质量损失阶段：第1阶段为40～170 ℃，在不含乙醇条件下SF水溶液形成的水凝胶内部的结合水含量最高，质量损失率约为11.41%；第2阶段为220 ℃以后，当温度达到400 ℃时，SF-0的残炭率为46.45%，随着乙醇的增加，样品的质量残留量逐渐增大，当质量分数为10.0%时，残炭率达到49.05%。说明乙醇质量分数的增加促进了水凝胶热稳定性的增强，这与上述结果相吻合。

2.4 SF水凝胶的孔隙率和吸水率分析

孔隙率和吸水率是评价三维材料的一个重要指标，不仅受内部结构的影响，还与性能密切相关。本文计算出乙酸-乙醇诱导SF水凝胶的孔隙率和吸水率，当无乙醇加入时，SF-0水凝胶的孔隙率为(95.47±0.24)%， 随着乙醇质量分数的升高，孔隙率没有明显变化，始终集中在95%附近，与SF-0样品相近，说明乙醇的加入对水凝胶的孔隙率影响不大。SF-0、SF-1、SF-2.5、SF-5、SF-10样品的吸水率分别为(2 040±108.5)%、(1 516±275.6)%、(2 367±333.3)%、(2 669±135.4)%、(2 286±672.6)%，说明随着乙醇质量分数的增加，吸水率呈现先增加后降低的趋势，与水凝胶形貌(由片层结构转化为纤维状，并随着乙醇质量分数增大纤维直径逐渐增大)的变化趋势相吻合，当乙醇质量分数为5.0%时吸水率最大。这可能由于此时水凝胶内部为纤维结构且直径较小时，比表面积增大，更有利于水分子的吸附。

2.5 SF水凝胶的压缩力学性能分析

选取SF-0和SF-5这2组样品的力学性能进行对比，压缩性能测试结果如图6所示。由图6(a)可以看出，干态下水凝胶的应力-应变曲线大致可分为3个阶段，分别为低应变下的线性弹性区间(大概在0%～15%范围内)，中等应变下的非线性塑性变形平台(15%～45%)以及高应变下应力急剧增加区(45%以上)[31]。相较于SF-0水凝胶，SF-5水凝胶的压缩强度有了显著的提高，当压缩应变为60%时，SF-5水凝胶的压缩强度可达到(75.16±3.79) kPa，而SF-0水凝胶的压缩强度仅为(50.76±5.21) kPa，相较于以前通过其他制备工艺获得的纯SF纤维结构水凝胶((31.9±2.6) kPa[35])，有了显著提高。在压缩应变达到20%之前，SF-0水凝胶的压缩强度明显高于SF-5水凝胶，但SF-5水凝胶的线性弹性区间(0%～30%)明显长于SF-0水凝胶(0%～15%)， 说明在压缩应变从0%到30%的过程中，SF-5水凝胶内部可能再分为2个阶段：首先是0%～15%压缩应变阶段，水凝胶内部纤维支架的压缩起到一定的缓冲作用，故此阶段上升趋势较缓；当压缩应变超过15%时，SF分子链开始伸长、舒展，因此，在15%～30%压缩应变阶段大致呈线性增长。从总体上来看，SF-5水凝胶的压缩强度显著高于SF-0水凝胶，原因大致有2个方面：一方面是结构上的差异，均匀的三维纤维支架能够存储和损耗较多的能量；另一方面，SF-5水凝胶内部结晶区所占比例较大(形成大量的β-折叠结构)，分子间形成紧密的氢键相互作用，进一步阻碍了分子链的断裂、滑移。由图6(b)可知，湿态条件下SF-5水凝胶的压缩强度可达到(7.2±0.3) kPa，且经过5次反复的压缩测试，水凝胶的回复率能够达到伸长的63%，表明SF-5水凝胶具有良好的柔韧性。

图6 干态和湿态条件下丝素蛋白水凝胶的压缩性能Fig.6 Compressive property of SF hydrogels in dry and wet state. (a) Compressive property in dry state; (b) Cyclic compressive property in wet state

3 结 论

本文制备了一种形貌可控、性能稳定的丝素蛋白(SF)水凝胶。通过改变SF溶液中乙醇的质量分数，探讨并分析影响水凝胶形貌成形的因素，以及聚集态结构、热稳定性能、力学性能的变化情况。实验发现，随着乙醇质量分数的增加，SF溶液凝胶时间逐渐缩短，SF的无规卷曲构象进一步转变成β-折叠构象；水凝胶形貌由均匀分布的孔洞结构逐渐向纤维结构转变，且纤维化越趋明显，当质量分数为5.0%时，纤维直径达到(1.09±0.5) μm，如果乙醇的质量分数超过10.0%达到20.0%时，水凝胶冻干后将无法保持稳定的立体骨架结构。此外，随着乙醇的加入，水凝胶的力学性能也有所改善，在干态下应变为60%时的压缩强度从(50.76±5.21) kPa(乙醇的质量分数为0%)提高到(75.16±3.79) kPa(乙醇的质量分数为5.0%)，且在湿态下样品的压缩强度增加为(7.2±0.3) kPa，回复率达到伸长的63%，具有良好的强力和韧性。该丝素蛋白水凝胶可应用于组织支架、生物矿化等领域，具有一定的潜在价值。