MALDI-TOF MS对临床侵袭性丝状真菌的快速鉴定技术的研究

张景 姜斌 彭娜 欧阳鹏文 徐文 宁兴旺 刘琼 谢良伊

[1.湖南省人民医院(湖南师范大学附属第一医院)检验科，长沙 410005；2.湖南省中医药大学第一附属医院医学检验中心，长沙 410007]

侵袭性丝状真菌是引起免疫功能不全或有基础疾病的患者呼吸道感染和死亡的重要原因，且具有病情危重、发展迅速、临床预后差以及病死率高等特点，应引起高度重视[1]。传统丝状真菌鉴定方法主要依靠形态学的观察，有时难以得到准确的鉴定结果。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)是近年来发展起来的一种非常重要的病原微生物鉴定的新方法[2]，除了有较高的准确性外，其最大优点是能在很短时间内完成病原微生物的鉴定，具有操作简便、鉴定迅速、准确率高和成本低的特点，近年来开始用于细菌、酵母菌及丝状真菌的鉴定，可替代常规鉴定方法，降低周转时间[3-4]。

本文对从临床患者分离了91株常见丝状真菌，用MALDI-TOF MS和传统形态学方法同时进行鉴定，采用分子测序方法作为“金标准”，验证质谱技术的鉴定结果，探讨质谱技术在丝状真菌鉴定中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

收集2017年4月—2019年7月本院各种类型临床标本中分离培养的65株丝状真菌(已剔除同一患者多次送检培养后所得同一种菌)，以及某三甲医院惠赠的26株丝状真菌，总共91株临床常见的丝状真菌。初步鉴定为丝状真菌的菌株保存在菌种保存管里，将其置于-80℃冰箱冷冻保存。大肠埃希菌ATCC8739作为校准和内质控菌株，ATCC16888黑曲霉及ATCC10106产黄青霉作为研究质控菌株。

1.2 试剂与仪器

沙堡弱葡萄糖琼脂培养基(含氯霉素)(Sabouraud gentamicin chloramph agar, SGC)、哥伦比亚血琼脂培养基(Columbia agar+5% sheep blood, COS)(法国梅里埃生物公司)；棉蓝染色液(珠海贝索生物有限公司)；VITEK MS质谱仪、VITEK MS-CHCA基质液、质谱仪样品靶板(法国梅里埃生物公司)；甲酸、乙腈(国药集团化学试剂有限公司)；引物合成及PCR产物序列测定均由上海英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

1.3 方法

传统形态学鉴定(生物安全柜中进行) 将菌库中丝状真菌在SGC平板上进行复苏，用封口膜封口，置于28℃及35℃孵箱中培养1～5 d，至丝状真菌长出后挑取单个菌落点种在SGC平板上，并置于28℃孵箱中培养1～5 d，取一清洁载玻片，在其上滴加棉蓝染液1滴，然后用透明胶带蘸取少许菌丝后贴于载玻片上，在显微镜下进行传统形态学观察鉴定，包括其菌丝、孢子的形态及产孢方式等，同时结合菌落生长速度、形态、质地和颜色等进行形态学鉴定。

分子生物学检测 采用SGC平板上复苏点种后的临床菌株，利用磁珠研磨煮沸法提取其DNA，以ITS1-F/ITS2-R、β-微管蛋白(F/R)为引物，将提取的DNA进行PCR扩增，引物具体编码为ITS1-F：TCCGTAGGTGAACCTGCGG、ITS2-R：TCCTCCGCTTATTGATATGC、β-微管蛋白-F：AATTGGTGCCGCTTTCTGG、β-微管蛋白-R：AGTTGTCGGGACGGAATAG。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并将电泳后产物进行核酸序列测定。测序结果在美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)上进行基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)比对，确定丝状真菌种类。

丝状真菌质谱鉴定 在生物安全柜中，分别挑选点种在SGC平板上，于28℃和35℃两种温度下孵育后生长的菌落进行两种不同前处理。①质谱仪推荐“甲酸乙腈法”提取丝状真菌蛋白：利用一次性200 μLTip取直径1～2 cm的菌落，将其悬浮于75%无水乙醇中，充分震荡混匀；将混匀后的样本高速离心2 min，尽量吸除上清液，保留沉淀，自然干燥；在沉淀中加入40 μL70%甲酸，涡旋5～8 s；再向其混合物中加入40 μL乙腈涡旋5～8 s；将按上述实验所得混合物静置5～10 min后高速离心2 min；立即在质谱仪专用样品靶板上加入1 μL离心后所得的上清液，待自然干燥后加1 μL基质液覆盖在样品靶板上，室温下干燥后上机检测，判读结果。② “磁珠研磨法”提取丝状真菌蛋白：前面同“传统形态学鉴定”的前3步；向沉淀-甲酸混合物中加入等体积的0.1 mm磁珠进行充分研磨，并震荡混匀；再向其所得混合物中加入40 μL乙腈涡旋5～8 s；将按上述实验所得混合物静置5～10 min后高速离心2 min；立即在质谱仪专用样品靶板上加入1 μL离心后所得的上清液，待自然风干后加1 μL基质液以覆盖样品靶板，室温下干燥后上机检测，判读结果。

1.4 统计学分析

数据分析采用SPSS软件进行统计学分析，率的比较采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 传统形态学鉴定

91株丝状真菌通过传统形态学鉴定后，与DNA测序结果相比，仅有74株能够正确鉴定到种，91株能够正确鉴定到属。其中曲霉属鉴定到种的正确率为87.1%(74/85)，青霉属鉴定到种的正确率为0/4。

2.2 DNA测序

91株丝状真菌DNA在2对引物下进行PCR扩增，将其产物进行电泳，其中ITS1-F/ITS2-R扩增产物条带在500～700 bp，详见图1；而β-微管蛋白(F/R)扩增产物条带为200～600 bp，详见图2。另外，将上述扩增产物送至公司测序，经结果拼接比对后进行比对，确定菌种。

图1 丝状真菌基因组DNA引物为ITS1-F/ITS2-R时PCR扩增产物电泳图 图2 丝状真菌基因组DNA引物为β-微管蛋白时PCR扩增产物电泳图

2.3 两种温度培养及两种不同蛋白提取的前处理方法对常见丝状真菌的鉴定结果比较

在该实验中，探索28℃和35℃条件下培养的丝状真菌在质谱仪鉴定时的鉴定结果有无差别，将两组样本进行独立样本χ2检验，统计量χ2=0.225，P=0.813>0.05，差异无统计学意义。从实验结果可知，两个温度下培养丝状真菌的正确鉴定率无明显差异，表明在应用质谱仪鉴定常见丝状真菌时培养温度不影响其鉴定结果，具体数据见表1。

表1 91株常见丝状真菌在两个温度培养及不同蛋白提取方法质谱鉴定结果比较

在质谱仪鉴定丝状真菌时，丝状真菌菌体蛋白的提取方法不同，其鉴定准确率也不同[5]。通过“磁珠研磨法”[6]与质谱仪推荐“甲酸乙腈提取法”这两种不同方法，提取丝状真菌的蛋白，将两组样本进行独立样本χ2检验，统计量χ2=6.71，P=0.018<0.05，提示差异有统计学意义，从其丝状真菌的正确鉴定率可知，“磁珠研磨法”提取蛋白后质谱仪鉴定的正确率优于质谱仪推荐“甲酸乙腈提取法”，两种不同蛋白质提取方法的数据比较见表1。

2.4 形态学鉴定、质谱仪鉴定与DNA测序鉴定结果的比较

与DNA测序结果相比，91株常见丝状真菌通过传统形态学鉴定，其鉴定到种的正确率为81.3%(74/91)；通过梅里埃质谱仪鉴定，丝状真菌鉴定到种的正确率为97.8%(89/91)。具体数据见表2。

表2 形态学和MALDI-TOF MS和DNA测序鉴定结果的比较

3 讨 论

MALDI-TOF MS是目前临床微生物鉴定领域的一项新技术，具有成本低、耗时短、客观、准确、高效等优点，有强大的鉴定能力。现阶段，它不仅在细菌与酵母菌检测上得到较高的应用，在细菌的同源性分析、耐药性上也有一定的研究，而且在血培养阳性率的检测以及鉴定上也有很好的应用前景。由于其结构的复杂性，侵袭性丝状真菌需要在对菌落进行预处理，提取充足的蛋白质后才能进行质谱鉴定。本研究采用MALDI-TOF MS技术对分离自临床的91株常见丝状真菌分离株进行鉴定，并与传统形态学方法和基因测序鉴定结果进行比对，评价MALDI-TOF MS技术在临床丝状真菌鉴定中的应用价值；并通过“质谱仪推荐方法”与“磁珠研磨法”提取丝状真菌蛋白进行比较，评价两种方法在临床工作的应用价值；同时，探索MALDI-TOF MS在鉴定丝状真菌时的菌株前处理的方法，以及培养条件与鉴定结果的相关性。

本研究数据显示，使用质谱仪鉴定丝状真菌时，运用“磁珠研磨法”提取蛋白时，不管是28℃还是35℃时的鉴定结果，均无差异；而推荐方法“甲酸乙腈法”提取丝状真菌时，其在28℃和35℃时的鉴定结果虽然稍有区别，但是28℃和35℃两种温度条件下培养的菌株鉴定正确率，经过统计学分析其差异无统计学意义，说明在临床常规工作中使用质谱仪鉴定常见丝状真菌时，培养温度不会影响其鉴定结果。丝状真菌细胞壁的厚度为100～200 nm，具有较强的细胞壁韧性和稳定性，所以一般的破壁方式难以得到较好的蛋白质图谱[7]。然而，Vermeulen等[8]在使用MALDI-TOF MS技术鉴定时，细胞裂解法得到的鉴定结果明显优于完整细胞法。在进行本研究时，不断摸索提取丝状真菌蛋白的方法，优化实验条件，总结使用质谱仪推荐的“甲酸乙腈提取法”及改良的“磁珠研磨法”在提取丝状真菌蛋白后，对丝状真菌鉴定率的影响。

本研究中，质谱仪推荐的“甲酸乙腈提取法”提取蛋白的操作相对简单方便，但其对丝状真菌质谱鉴定的正确率为90.1%(82/91)，低于“磁珠研磨法”的97.8%(89/91)；而“磁珠研磨法”的操作虽较质谱仪推荐的方法繁琐，但实验室也能常规开展，能够充分研磨从而达到破壁效果，且提取真菌蛋白的效果较好，其正确鉴定率远高于质谱仪推荐“甲酸乙腈提取法”。Bille等[9]则将64株曲霉菌的孢子或菌丝与甲酸乙腈预先混合在靶板上，然后进行裂解，通过对“甲酸乙腈提取法”进行简化后，其检测准确率可以达到86%。而Hettick等[10]对12株曲霉菌属和5株不同的黄曲霉菌，利用磁珠破碎法进行破壁等预处理，得到的鉴定结果表明，该方法处理后的鉴定结果可以达到菌种水平的准确鉴定。此外，对12株青霉菌分析表明，该法对青霉菌鉴定的准确率可达100%[11]。Lau等[12]采用相同磁珠破碎法对该方法进行重复性实验，结果表明，421株丝状真菌正确鉴定到种和正确鉴定到属的正确率分别达到370(88.9%)株和388(93.2%)株。本研究通过对91株临床菌株分别进行“甲酸乙腈提取法”和“磁珠研磨法”的预处理，其研究结果验证了两种方法在提取蛋白质的不同，并且证实了“磁珠研磨法”鉴定丝状真菌优于常规推荐的方法。可知在临床工作中，我们可以通过不断的摸索和探究找到既方便又高效的方法应用于临床，提高临床工作的效率。

在该研究中，通过MALDI-TOF MS质谱技术对91株常见菌株进行鉴定，并与DNA测序的结果进行了比较，其中有97.8%(89/91)的丝状真菌菌株能够正确鉴定出来，其中曲霉属和青霉属鉴定到种的正确率均为100%；而传统形态学方法仅有74株能够正确鉴定到种，91株能够正确鉴定到属。该结果与Becker等[13]的研究结果相同，表明MALDI-TOF MS技术在对常见丝状真菌的鉴定上有较高的应用价值。并且质谱技术对曲霉菌的正确鉴定率为100%(85/85)。有研究学者利用MALDI-TOF MS技术检测44株曲霉属，成功鉴定36株[14]。如果仅计算数据库中包含的菌株，则可以准确鉴定100%(144/144)曲霉属，而曲霉属93.6%(133/144)能够准确鉴定到种[15]。本研究结果验证了这一结论。而对于2株镰刀菌来说，其鉴定的正确率为0。上述结论的原因可能有：①本研究中此类菌种菌株的样本少，无法在大数据库中得出准确的结果。②部分少见丝状真菌在DNA测序中仅能鉴定到属，无法确定其菌种。③该质谱仪数据库中缺乏此类菌种的指纹图谱，难以得到较准确的鉴定结果。本研究中黄曲霉和米曲霉难以通过DNA测序区分开，可能与两者间高度的同源性有关。且黄曲霉和米曲霉通过质谱技术也难以鉴别，可能是产生了某种色素干扰鉴定结果，尽管可以得到蛋白质图谱，但是造成在蛋白质图谱中某些临床菌株中缺乏特定峰值或峰数不足，即使与数据库进行比对，却无法获得准确鉴定结果[5]。

综上所述，虽然本研究中实验菌株数量及菌种种类较少，但是仍在一定程度上证实了MALDI-TOF MS技术的优越性，说明其在临床丝状真菌鉴定中的应用前景广泛，具有快速、简单、成本低及对实验人员技术要求较低等优点。随着蛋白提取方法的不断改善和丝状真菌的数据库的不断完善，MALDI-TOF MS技术将为临床早期诊断和及时用药提供快速、有力的证据。