可视化跨越式滚环扩增技术检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌

苑 宁，张蕴哲，张海娟，于 泽，卢 鑫，张 伟,,3,*

（1.河北农业大学理工学院，河北 沧州 061100；2.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071000；3.河北农业大学生命科学学院，河北 保定 071000）

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）能引起人类患病[1]。世界卫生组织将单核细胞增生李斯特氏菌列为仅次于大肠杆菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌的世界第四大食源性病原菌[2]。单核细胞增生李斯特氏菌是胞内致病菌，易交叉污染[3]，感染后会出现严重的症状[4-6]。感染李斯特氏菌的婴幼儿会患上脑膜炎、败血症等，被感染的孕妇则会出现流产或死胎的症状[7]。调查显示，我国各地均存在程度不同的单核细胞增生李斯特氏菌污染食品的情况[8-13]。

传统检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法过程繁琐、检验时间长，对于一些菌含量较少的样品不易检出，容易出现假阴性结果[14]。免疫学的检测方法比较繁琐，而且抗体的获取需要专业的技术人员进行操作[15]。随着分子生物学和基因组学的不断发展，各种分子生物学检测方法逐渐建立起来，主要是以变温核酸扩增技术聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）[16]、实时PCR（real-time PCR）[17]为代表的定性和定量检测方法，需要较昂贵的温度循环控制设备PCR仪和特别昂贵的real-time PCR仪，限制了其在基层检测机构中的推广和应用。此外，还存在因扩增效率不高导致的灵敏度较低等问题。为了解决这些问题，人们发明了无需昂贵的扩增仪器、扩增效率较高的核酸等温扩增技术。Lizardi等[18]建立了滚环扩增技术（rolling circle amplification，RCA）检测人类基因组DNA中的点突变，并得到了一定的应用[19-20]。近年来，RCA技术在食品病原菌的检测中得到了一定发展[21]，但RCA要求模板为环状DNA，若扩增线性DNA，需要锁式探针和连接酶，操作步骤繁琐、反应时间长、成本很高，因此限制了RCA技术的推广。

本实验发现BstDNA聚合酶扩增DNA的一种新特性，该酶在一对引物的作用下，通过添加碱基的方式跨越靶序列两端的缺口，形成非闭合环状DNA，并进行开环式的滚环扩增，完成对线性DNA的扩增，以此为基础，与荧光染料相结合，采用可视化跨越式滚环等温扩增（saltatory rolling circle amplification，SRCA）技术。SRCA扩增原理如图1所示，预变性后双链DNA变成单链DNA，由于单链DNA自身结构形成非闭合环状结构，在60～65 ℃，正向引物（forward primer，FWP）结合到模板上互补的位置。然后，FWP在BstDNA聚合酶的作用下进行扩增（步骤（4））。当FWP沿模板的3’末端扩增到5’末端，在BstDNA聚合酶的作用下不依赖模板添加一个或多个碱基跨过缺口[22]，同时置换先前合成的DNA链（步骤（5）、（6））。随着单链DNA延伸，反向引物（reverse primer，RVP）的多个结合位点暴露，RVP结合到目标单链DNA上在BstDNA聚合酶的作用下继续扩增（步骤（7）、（8））。之前的扩增产物被不断置换下来（步骤（9））。FWP与相应的互补区域结合并进行链的延伸，周而复始，最终形成由大量不同长度的线性双链DNA组成的产物（步骤（10）、（11））。

图1 SRCA反应原理图Fig. 1 Schematic diagram of the SRCA assay

SRCA只需要利用一对引物即可实现线状DNA的扩增，不需要锁式探针和连接酶，而是利用线状模板的自身结构与BstDNA聚合酶的特性进行反应。与RCA相比，SRCA操作大大简化，成本降低约90%，耗时缩短3 h以上，突破了滚环扩增技术应用的瓶颈。

本研究以hlyA基因为靶基因，通过大量实验筛选出了一对适宜的引物，建立一种检测单核细胞增生李斯特氏菌的新型滚环扩增方法，即可视化SRCA，并对此方法进行评价，旨在为开发单核细胞增生李斯特氏菌SRCA检测试剂盒奠定基础，为食品中致病菌的快速检测提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

本研究所用菌株如表1所示。

表1 本研究所用菌种Table 1 Bacterial strains used in this study

1.1.2 试剂

细菌DNA提取试剂盒、BstDNA聚合酶（Large fragment）、SYBR Green I荧光染料、DraI限制性核酸内切酶 大连宝生物工程有限公司；TaqDNA聚合酶、Easypure®Quick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒、基因克隆T3载体试剂盒、100 bp DNA Ladder、dNTPs 北京全式金生物技术有限公司；1%盐酸吖啶黄溶液、1%萘啶酮酸钠盐溶液、单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定试剂盒、异丙醇、无水乙醇 北京陆桥技术股份有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

2720 Thermal cycler核酸扩增仪 美国Applied Biosystems公司；DYY-8C型电泳仪 北京市六一仪器厂；BILON-08无菌均质器 西安比朗生物科技有限公司；BINDA 2020D凝胶成像仪 北京宾达英创有限公司；NanoDrop 2000分光光度计 美国Thermo Scientific公司；BSC-1500IIB2-X生物安全柜 鑫贝西Biobase公司。

1.3 方法

1.3.1 引物设计

hlyA基因的序列具有高度保守性[23]，本研究选取hlyA基因为单核细胞增生李斯特氏菌的靶基因，根据GenBank公布的hlyA基因序列进行BLAST同源性分析，利用DNAMAMN和Primer Premier 5.0软件设计引物，并由北京华大公司合成引物，具体引物序列如表2所示。

表2 单核细胞增生李斯特氏菌hlyA基因的引物Table 2 Primers used for amplification of hlyA gene in L. monocytogenes

1.3.2 细菌的培养与DNA提取

将保存的各菌株（表1）接种到营养肉汤中，37 ℃过夜培养，再转接到营养琼脂平板上培养，挑取单菌落接种到营养肉汤中37 ℃过夜培养，备用。

培养菌液采用试剂盒法提取基因组DNA。通过Nanodrop 2000分光光度计测定基因组浓度。

1.3.3 SRCA和PCR体系

优化建立最佳的SRCA扩增体系：5 μL dNTPs（4 种均为2.5 mmol/L），2.5 μL Mg2+（20 mmol/L），2 μL 10×ThermoPol buffer，1 μL上游引物（10 μmol/L），1 μL下游引物（10 μmol/L），1 μL模板DNA（阴性对照不添加模板），1 μLBstDNA聚合酶（320 U/mL），无菌去离子水补足体系至20 μL。94 ℃预变性3 min，冰浴2 min；然后62 ℃反应60 min；最后80 ℃反应5 min，反应停止。

为评估SRCA方法的灵敏度和检出限，本研究同时应用了PCR方法。其反应体系（25 μL）如下：2×EasyTaqPCR Super Mix 11.0 μL，正反向引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，剩余体积由无菌去离子水补足。反应程序：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s（变性-退火-延伸，25 个循环），72 ℃再延伸45 s终止。

1.3.4 SRCA产物可视化分析

向SRCA扩增产物中加入1 μL荧光染料SYBR Green I，直接肉眼观察颜色变化，进行可视化分析。

1.3.5 SRCA扩增产物测序分析和酶切分析

选取典型的梯形条带，自最小片段起依次切取4 个条带进行胶回收，反应产物纯化测序。为进一步验证SRCA产物是否为目的条带，本实验采用DraI限制性内切酶对产物进行酶切验证，在37 ℃反应2.5 h。反应完成后进行凝胶电泳，以观察酶切结果。

1.3.6 SRCA引物特异性分析

为验证本研究中引物在SRCA反应中的特异性，共对52 株菌株进行分析，其中包括2 株单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株，10 株单核细胞增生李斯特氏菌株（实验室分离菌株）及40 株非单核细胞增生李斯特氏菌菌株（表1），并通过荧光可视法进行结果分析。

1.3.7 SRCA灵敏度分析

为评估SRCA检测纯菌DNA的灵敏度，取上述过夜培养的纯菌液1 mL提取模板DNA，并用无菌去离子水进行10 倍梯度稀释，进行扩增后，通过荧光可视法进行分析，确定SRCA反应的灵敏度。同时以PCR检测方法为对照，PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，确定PCR的灵敏度。

纯菌液经Nanodrop 2000分光光度计测定质量浓度为8.9×107fg/μL。

1.3.8 SRCA人工污染凉拌菜中单核细胞增生李斯特氏菌的检出限分析

称取经验证未受到单核细胞增生李斯特氏菌污染的凉菜25 g，加入单核细胞增生李斯特氏菌LB1增菌液中均质，取过夜培养的单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株（CMCC 54001）的纯菌液1 mL，加入含有9 mL均质液的试管中，吹吸混匀，然后进行10 倍梯度的连续稀释。每个稀释度菌悬液均取1 mL，提取基因组DNA，SRCA方法扩增，通过荧光可视化法确定SRCA方法的检出限。

以PCR方法为对照，通过凝胶电泳法确定PCR方法的检出限。

与此同时，另取1 mL上述纯菌液，用0.85%的生理盐水进行10 倍梯度的连续稀释，每个稀释度各取1 mL加入李斯特氏菌显色平板，36 ℃培养48 h，记录单核细胞增生李斯特氏菌阳性菌落数。根据平板计数法获得人工污染的凉拌菜中单核细胞增生李斯特氏菌浓度范围2.8×108～2.8×10-1CFU/mL。

1.3.9 SRCA方法的实际应用与评估

为检验SRCA方法对实际样品中单核细胞增生李斯特氏菌的检出情况，在当地各大超市及市场随机购买70 份易被单核细胞增生李斯特氏菌污染的样品，包括成品果蔬22 种、生食果蔬23 种、豆制品6 种、熟肉制品13 种、其他类型6 种，利用GB 4789.30—2016《食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》[24]、PCR及SRCA 3 种方法对以上样品进行检测。

以GB 4789.30—2016检测结果为基准，采用敏感性、特异性及符合率3 个指标对SRCA方法进行评价。计算公式[25-28]如下：

2 结果与分析

2.1 荧光可视化法观察SRCA扩增产物

SRCA反应结束后，向反应管中加入1 μL的荧光染料SYBR Green I，结果如图2所示。添加了单核细胞增生李斯特氏菌的阳性反应管1颜色由橙色变为绿色，而阴性对照2仍为橙色。

图2 SRCA荧光可视化结果Fig. 2 Visual results of the SRCA products

2.2 SRCA扩增产物测序和酶切结果分析

如图3A所示，SRCA扩增产物经过DraI限制性内切酶切消化后，其酶切片段为109 bp左右，与理论计算值一致。为了进一步验证SRCA产物，对图3A中的扩增产物电泳条带（1～4）进行测序分析。测序结果如图3B所示，发现SRCA的反应产物含有多个重复的特异性靶序列，且随着靶序列拷贝数目增加，产物片段长度随之增加。利用两条具有特异性的引物，通过SRCA反应可以特异性的扩增目的片段，因此，可以验证本研究中建立的SRCA方法检测单核细胞增生李斯特氏菌原理的正确性。

图3 单核细胞增生李斯特氏菌SRCA反应的酶切和测序结果分析Fig. 3 Enzymatic digestion and sequencing analysis of the SRCA products of L. monocytogenes

2.3 SRCA方法的特异性

本研究针对52 株菌株进行特异性分析，检测结果如图4所示。其中，12 株单核细胞增生李斯特氏菌发生了SRCA反应，而其他40 株非单核细胞增生李斯特氏菌均未发生SRCA反应。说明该引物具有良好的特异性。SRCA检测方法的特异性取决于引物的设计和筛选，需要从设计出的大量引物中通过大量实验筛选出一对合适的引物，这也是本研究的难点。

图4 SRCA特异性分析Fig. 4 Specificity of SRCA evaluated by fluorescence staining

2.4 单核细胞增生李斯特氏菌纯培养的灵敏度

以1.3.7节中提取的基因组DNA作为模板进行SRCA反应，向得到的反应产物中添加1 μL荧光染料SYBR Green I。如图5A所示，在模板DNA质量浓度范围为8.9×107～8.9×100fg/μL时，反应管中出现绿色，质量浓度小于8.9×100fg/μL时仍然为橙色，因此，SRCA荧光可视法基因组灵敏度为8.9×100fg/μL。

用相同的模板进行PCR，得到的反应产物进行凝胶电泳。如图5B所示，在模板DNA质量浓度范围为8.9×107～8.9×103fg/μL时，出现了阳性扩增条带，因此，PCR方法检测单核细胞增生李斯特氏菌基因组的灵敏度为8.9×103fg/μL。

图5 SRCA方法（A）和PCR方法（B）检测的灵敏度Fig. 5 Sensitivity of SRCA (A) and PCR (B)

由此可知，SRCA方法检测的灵敏度是PCR方法检测灵敏度的1 000 倍。

2.5 人工污染凉拌菜单核细胞增生李斯特氏菌的检出限

利用SRCA和PCR方法对单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株污染的凉拌菜进行检测，结果如图6所示。图6A反映了SRCA方法的检测结果，当人工污染的凉拌菜中菌浓度为2.8×108～2.8×100CFU/g时，反应管中出现绿色，当浓度为2.8×10-1CFU/g时反应管中的颜色依然为橙色。因此，SRCA荧光可视法检出限为2.8×100CFU/g。

图6 SRCA（A）和PCR（B）方法检出限Fig. 6 Detection limits of SRCA (A) and PCR (B)

图6B反映了PCR方法检测的结果，当人工污染的凉拌菜中菌浓度为2.8×108～2.8×103CFU/g时，出现了阳性扩增条带，菌浓度小于2.8×103CFU/g时未出现扩增条带，因此，PCR方法检测人工污染凉拌菜中单核细胞增生李斯特氏菌的检出限为2.8×103CFU/g。

由此可知，SRCA方法的检出限是传统PCR方法检出限的1/1 000。

2.6 实际样品的检测与SRCA方法的评估

利用GB 4789.30—2016、PCR和SRCA三种方法对70 份食品进行检测，结果见表3。SRCA和PCR方法均会出现假阳性，主要原因在于检测过程中无法区别死菌和活菌，传统培养方法不能检测出死菌和不可培养状态的菌株（viable but non-culturable，VBNC），而其DNA在SRCA和PCR方法中却可扩增，即通过SRCA和PCR方法可以检测到死菌及VBNC状态的单核细胞增生李斯特氏菌。除此之外，由于SRCA方法检测的灵敏度更高，因此出现的假阳性数量比PCR方法多。

表3 SRCA方法评价Table 3 Evaluation of the SRCA method

3 结 论

本研究筛选出了一对适宜的引物，成功建立了SRCA快速检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的方法，并通过肉眼观察荧光判断结果，方便简单。利用SRCA技术对12 株单核细胞增生李斯特氏菌和40 株非单核细胞增生李斯特氏菌进行特异性检测，其中12 株单核细胞增生李斯特氏菌显示为阳性，其他均显示阴性结果，证明该方法具有较好的特异性。SRCA技术检测单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏度为8.9×100fg/μL，是传统PCR方法的1 000 倍，人工污染凉拌菜样品中的单核细胞增生李斯特氏菌检出限为2.8×100CFU/g，是传统PCR方法的1/1 000，因此SRCA技术具有更高的灵敏度和更低的检出限。使用GB 4789.30—2016法、PCR和SRCA法对70 种实际样品进行单核细胞增生李斯特氏菌的检测，并以GB 4789.30—2016法为标准对SRCA方法进行评估，其敏感性为100%，特异性为97.01%，符合率为97.14%。

本研究建立的SRCA方法用于检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测切实可行，SRCA方法具有操作简便、节省时间、成本低廉、灵敏度高、稳定性好的优势。说明SRCA方法非常适合在中小型企业和基层检测机构以及现场快速检测中推广应用。在后期的研究中，SRCA方法可与叠氮溴化丙锭[29]、叠氮溴化乙锭等结合，区分死活菌，进一步实现结果判断的准确性。开发单核细胞增生李斯特氏菌SRCA检测试剂盒，大力推广该技术。