生物合成天然2-苯乙醇细菌的筛选及合成途径分析

荣绍丰，伍 进，管世敏，蔡宝国，张 硕，李茜茜

（上海应用技术大学香料香精技术与工程学院，上海 201418）

2-苯乙醇因具有令人愉悦的香甜味，不仅可以作为食品添加剂对发酵食品中的其他风味物质起到协调及增效的作用[1]，而且在药品、化妆品等领域的应用也十分广泛。目前, 2-苯乙醇主要通过化学合成法制备，但此法原料具有致癌风险，而且产物中常含有一些难以去除的副产物，严重影响了产品质量，极大限制了产品的使用范围[2]。物理提取法可从植物中提取天然2-苯乙醇，但由于植物资源有限、提取效率低等原因不能满足市场的大规模需求[3-4]。微生物转化法[5]生产天然2-苯乙醇不仅可以满足市场需求，而且得到的产品安全天然[6]，是合成天然2-苯乙醇工业化新趋势。

微生物转化法生产天然2-苯乙醇的菌种主要有酵母菌、真菌和细菌[7-8]。合成2-苯乙醇代谢途径主要有3 条，即艾氏途径、苯乙胺途径和从头合成途径（图1）[9]。目前，研究和应用最广泛的是酵母菌，如酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、异常威克汉姆酵母等[10-13]。酵母菌通常以L-苯丙氨酸为底物，通过艾氏途径合成2-苯乙醇。此外，真菌如米曲霉等可通过艾氏途径和苯乙胺途径合成2-苯乙醇[14]。细菌合成2-苯乙醇的报道较少，有研究显示肠杆菌属（Enterobactersp.）细菌能通过从头合成途径合成2-苯乙醇[15]。由于细菌具有生长速率快、无需以L-苯丙氨酸为底物合成2-苯乙醇等优点，可降低生产成本，因此具有应用潜力[16]。

图1 微生物合成2-苯乙醇的代谢途径Fig. 1 Metabolic pathway for biosynthesis of 2-phenylethanol in microorganisms

本研究从土样中分离筛选出1 株肠杆菌，该菌株不仅对2-苯乙醇有一定耐受，且可合成2-苯乙醇。从基因序列分析和生物转化实验两个层面对该菌株合成2-苯乙醇的代谢途径进行研究。可为天然2-苯乙醇的工业化生产提供优良的出发菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

土壤样品采集自上海海湾森林公园不同种类花的根部。

细菌基因组DNA快速抽提试剂盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；HBI肠杆菌科细菌生化鉴定试剂盒 青岛海博生物技术有限公司；L-苯丙氨酸、2-苯乙醇、苯乙醛、苯丙酮酸 美国Sigma公司；其余试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

GC6890-5973MS气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用仪、4890气相色谱仪、1260液相色谱仪 美国Agilent公司；Nicolet 670傅里叶红外光谱分析仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；UNIC7200紫外-可见分光光度计 上海旦鼎国际贸易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的筛选与鉴定

1.3.1.1 菌株的筛选

在超净工作台上称取采集的土样各5 g，分别加入含有100 mL无菌水的三角瓶中，在30 ℃、250 r/min条件下富集培养48 h。用无菌生理盐水将富集菌液稀分别释至10-4、10-5、10-6、10-7、10-8五个梯度，每个稀释度取500 μL涂布于肉膏蛋白胨（Luria-Bertani，LB）固体培养基上，30 ℃培养至长出菌落。挑单菌落反复划线培养至菌落形态单一。将各单菌落转接LB液体培养基，30 ℃培养24 h，取500 μL分别涂布于含6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0 g/L 2-苯乙醇的LB固体培养基上，30 ℃培养3～5 d。挑取能在含2-苯乙醇LB固体培养基上生长的单菌落，按1.3.3节方法发酵培养并按1.3.4所述方法提取发酵产物。通过GC-MS检测样品中2-苯乙醇含量，方法见1.3.5节。所有实验重复3 次。

1.3.1.2 16S rDNA鉴定

筛选获得的菌株接种至LB培养基，37 ℃、250 r/min条件下培养24 h。用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取基因组，用细菌16S rDNA通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’）进行PCR扩增[17]。扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司完成16S rDNA测序。测序结果上传至美国国立生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）进行BLAST比对，并用MEGA 5.1软件通过邻接法构建系统发育树。

1.3.1.3 革兰氏染色和生理生化鉴定

筛选获得的菌株进行革兰氏染色并镜检观察菌体形态。按HBI肠杆菌科细菌生化[18]鉴定试剂盒使用手册检测，并根据《伯杰氏细菌鉴定手册》[19]进行生理生化鉴定。

1.3.2 基因组测序及序列分析

按1.3.1.2节步骤提取筛选获得的菌株基因组并送至上海美吉生物医药科技有限公司进行基因组测序[20]。利用美吉生物云（https://www.i-sanger.com/）进行序列组装与注释。利用KEGG数据库（https://www.genome.jp/kegg/pathway.html）分析2-苯乙醇合成途径。

1.3.3 菌株发酵培养

挑取斜面保藏菌株接种于50 mL LB培养基中，在30 ℃、250 r/min条件下培养24 h。按5%接种量转接至发酵培养基[21]（L-苯丙氨酸3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，磷酸氢二钾3.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，pH 7.0），相同培养条件下发酵48 h。

1.3.4 2-苯乙醇的提取

发酵液于8 000 r/min离心10 min。上清液加入二氯甲烷进行萃取，体积比为1∶1。萃取30 min后取有机相，用0.22 μm有机相滤膜过滤并收集滤液。

1.3.5 2-苯乙醇检测

GC检测2-苯乙醇条件：色谱柱：Agilent色谱柱19091S-963（60 m×250 μm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃；升温程序：初始柱温50 ℃，以3 ℃/min升温至140 ℃，140 ℃保持5 min。载气（He）流速1.0 mL/min，分流比20∶1，进样量1 μL。

GC-MS检测2-苯乙醇方法：GC条件：色谱柱及进样温度与上述方法相同；升温程序：50 ℃保持1 min，以5 ℃/min升温至230 ℃，230 ℃保持10 min；载气（He）流速1.0 mL/min；进样量1 μL；分流比20∶1。MS条件：电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；母离子m/z122；激活电压0.8 V；传输线温度250 ℃；电子倍增电压1.3 kV；扫描范围m/z20～500。

2-苯乙醇采用外标法定量。配制不同质量浓度的2-苯乙醇（0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 g/L）标准品，在上述GC条件下作2-苯乙醇标准曲线。

1.3.6 红外光谱检测

将纯化的2-苯乙醇样品置于红外光谱仪上，在800～2 500 nm红外光谱范围内进行扫描，扫描次数32，分辨率为8 cm-1，探测器为InGaAs。使用空气作为参考，透射光程1.0 mm，对每个样品收集3 次光谱，取其平均光谱进一步分析。检测时环境温度20 ℃，相对湿度60%。

1.3.7 不同碳源、底物发酵产2-苯乙醇

将菌株接种于50 mL LB培养基，30 ℃、250 r/min培养24 h。无菌条件下将菌液于8 000 r/min离心10 min，并收集菌体。菌体用pH 7.4磷酸盐缓冲液洗涤3 次后以10%接种量转接于1.3.3节发酵培养基，其中L-苯丙氨酸质量浓度分别为3.0、6.0、9.0 g/L。将发酵培养基中的L-苯丙氨酸依次替换为葡萄糖（10.0、20.0、30.0 g/L）或苯丙酮酸（3.0、6.0、9.0 g/L）或苯乙醛（3.0、6.0、9.0 g/L），按1.3.3节方法发酵后，按1.3.4节方法提取2-苯乙醇，并按1.3.5节方法定量检测2-苯乙醇。实验重复3 次，取平均值。

1.3.8L-苯丙氨酸检测

高效液相色谱法检测L-苯丙氨酸浓度。流动相为甲醇-水7∶3，检测条件为：TC-C18色谱柱（250 mm×4.5 mm），流速1 mL/min，进样量10 μL，检测时间15 min，检测波长254 nm。

L-苯丙氨酸的标准曲线用外标法进行测定：配制不同质量浓度2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g/L的L-苯丙氨酸标准品，分别通过高效液相色谱检测获得相应检测峰面积。以L-苯丙氨酸峰面积为纵坐标、L-苯丙氨酸标准品质量浓度为横坐标绘制L-苯丙氨酸标准曲线。

2 结果与分析

2.1 肠杆菌的分离鉴定

从上海海湾森林公园采集的10 份土样中初筛获得44 株具2-苯乙醇耐受性菌株。各菌株2-苯乙醇耐受性结果见表1。其中，编号为1～35的单菌落2-苯乙醇耐受质量浓度为1.0 g/L，编号为36～44的单菌落2-苯乙醇耐受质量浓度为2.0 g/L。

表144 株菌株对2-苯乙醇耐受结果Table 1 Tolerance to 2-phenylethanol in 44 strains isolated in this study

进一步通过将初筛获得的44 株菌置于发酵培养基中进行复筛实验。在30 ℃、250 r/min条件下培养48 h后。取样通过GC分别检测L-苯丙氨酸和2-苯乙醇含量，以此评估44 株菌株产2-苯乙醇能力。其中40号菌2-苯乙醇质量浓度最高，达到0.52 g/L（表2）。

经过比较分析各菌株产2-苯乙醇能力，最终选择筛选获得的40号菌株产2-苯乙醇0.52 g/L且对2-苯乙醇耐受质量浓度达到2.0 g/L的细菌菌株。显微镜镜检结果表明，该菌细胞呈直短杆状，大小0.6～1.0 μm×1.5～3.0 μm，革兰氏染色阴性（图2A）。克隆该菌株16S rDNA（GenBank No. MG554655），并对测序结果进行BLAST分析和构建系统发生树（图2B），结果表明该菌株与肠杆菌属相似性达到99.0%[22]，初步确定该菌株属于肠杆菌属。

图2 肠杆菌革兰氏染色显微图（A）及其系统发生树（B）Fig. 2 Gram staining (A) and phylogenetic analysis (B) of Enterobacter sp. MF024

进一步根据《伯杰氏细菌鉴定手册》[19]进行生理生化鉴定，包括碳源同化、氮源同化和其他特征等实验。以大肠杆菌DH5α为对照，结果显示该菌具有典型的肠杆菌属细菌生理生化特征（表3），因此确定该菌属于肠杆菌属，命名为Enterobactersp. MF024。

表3 生理生化实验结果Table 3 Physiological and biochemical experiment results

2.2 Enterobacter sp. MF024菌株合成2-苯乙醇产物的鉴定

对筛选获得的Enterobactersp.MF024以3.0 g/LL-苯丙氨酸为唯一氮源生物转化48 h后，提取发酵液中2-苯乙醇进行GC-MS分析。如图3所示，在相同检测条件下，Enterobactersp.MF024发酵液中提取的2-苯乙醇出峰时间为29.705 min（图3A），与2-苯乙醇标准品（图3C）的出峰时间一致。由MS结果可知，Enterobactersp.MF024发酵液中提取的样品在m/z122出现吸收峰，为2-苯乙醇的碎片峰；在m/z91出现强吸收峰，为苯甲基的碎片峰（图3B）[4]。该结果与2-苯乙醇标准品（图3D）的各个峰一致。该发酵条件下2-苯乙醇产量为1.15 g/L。

图3 发酵液GC-MS鉴定结果Fig. 3 GC chromatograms and mass spectra of 2-phenylethanol standard and 2-phenylethanol in fermentation broth

进一步利用红外光谱法分析Enterobactersp. MF024发酵液中提取的2-苯乙醇样品（图4）。醇C—O键在1 260～1 000 cm-1有强吸收峰；在1 650～2 000 cm-1出现C—H和C＝C键的面内振动的泛频峰强度都很弱，可以判断是苯环的一取代物。在3 650～3 200 cm-1处为2-苯乙醇中O—H键的低频峰；2 940～2 970 cm-1处为—CH2—的吸收峰。该结果都与2-苯乙醇标准品特征峰一致。

图42 -苯乙醇红外光谱检测结果Fig. 4 Infrared spectra of 2-phenylethanol standard and 2-phenylethanol in fermentation broth

2.3 Enterobacter sp. MF024菌株基因组中参与2-苯乙醇合成途径关键基因分析

对Enterobactersp. MF024菌株基因组进行测序，该菌基因组大小为4 278 063 bp，共编码4 512 个基因，基因平均长度是948.15 bp，N50值为577 909 bp （GenBank No. VCBB00000000）。通过KEGG数据库比对，在Enterobactersp. MF024菌株基因组中发现了参与艾氏途径以L-苯丙氨酸为底物合成2-苯乙醇的转氨酶（基因aspC、hisC、tyrB）、苯丙酮酸脱羧酶（基因pdc）和乙醇脱氢酶（基因adhP、adhE）[23]。此外，发现了该菌的aroF、aroB、aroQ、aroE、quiA、aroK、aroA、aroC、pheA和tryA等10 个基因编码的酶参与了2-苯乙醇从头合成途径[24]。

2.4 Enterobacter sp. MF024菌株中2-苯乙醇合成途径的确定

由于微生物可通过从头合成途径、艾氏途径和苯乙胺途径3 个途径合成2-苯乙醇（图1），本研究对Enterobactersp.MF024菌株的2-苯乙醇合成途径进行分析。生理生化检测结果（表3）发现，该菌L-苯丙氨酸脱羧酶为阴性，此酶为L-苯丙氨酸催化生成苯乙胺的关键酶。该酶的缺失表明Enterobactersp.MF024菌株无法通过苯乙胺途径合成2-苯乙醇。

在艾氏途径中，以L-苯丙氨酸为唯一氮源，依次生成苯丙酮酸和苯乙醛两种中间产物，最终生成2-苯乙醇[7]。从头合成途径则无需添加L-苯丙氨酸，以葡萄糖为唯一碳源，通过一系列代谢途径后，依次合成苯丙酮酸和苯乙醛，最终生成2-苯乙醇。因此，在前期以L-苯丙氨酸为底物的发酵实验基础上，分别以苯丙酮酸、苯乙醛为底物，对Enterobactersp.MF024菌株进行发酵培养，进一步验证艾氏途径。此外，不添加底物而以葡萄糖为唯一碳源进行发酵培养，以验证从头合成途径。由图5 GC分析结果可知，无论是以苯丙酮酸、苯乙醛为底物发酵，还是以葡萄糖为碳源进行发酵，其产物均在29.704 min处有2-苯乙醇峰出现。MS结果进一步表明发酵产物都有2-苯乙醇的特征离子峰（m/z122、91）。因此，Enterobactersp.MF024菌株既能通过艾氏途径，又能通过从头合成途径合成2-苯乙醇。

图5 各底物发酵液的GC-MS鉴定结果Fig. 5 GC-MS identification of 2-phenylethanol in fermentation broths with various substrates

对Enterobactersp.MF024菌株两条2-苯乙醇合成途径的合成效率进行分析。当分别以10.0、20.0 g/L和30.0 g/L的葡萄糖为唯一碳源发酵48 h后（图6A），得到2-苯乙醇质量浓度分别为0.45、0.49 g/L和0.56 g/L。因此，在一定范围内，随着葡萄糖初始质量浓度的提高，2-苯乙醇产率相应提高。当分别以3.0、6.0 g/L或9.0 g/L的L-苯丙氨酸为唯一氮源发酵48 h后（图6B），2-苯乙醇质量浓度分别为1.02、1.07 g/L和1.15 g/L。因此，在一定范围内，随着L-苯丙氨酸初始质量浓度的提高，2-苯乙醇的产率相应提高。当分别以3.0、6.0 g/L或9.0 g/L的苯丙酮酸为底物发酵48 h后（图6C），2-苯乙醇质量浓度分别达到0.35、0.39 g/L和0.41 g/L。当分别以3.0、6.0 g/L或9.0 g/L的苯乙醛为底物发酵48 h后（图6D），2-苯乙醇质量浓度分别达到1.63、1.68 g/L和1.75 g/L。由于苯丙酮酸与苯乙醛为从头合成途径和艾氏途径的中间产物，分别以两者为底物发酵时Enterobactersp. MF024菌株均能合成2-苯乙醇，且随着底物浓度的提高，2-苯乙醇产量相应提高，进一步表明该菌具备两种合成途径产2-苯乙醇的能力。

图6 2-苯乙醇合成效率结果Fig. 6 Synthetic efficiency of 2-phenylethanol with glucose as carbon source, L-phenylalanine as nitrogen source and different substrates

自20世纪80年代艾式途径报道以来，微生物转化法生产2-苯乙醇的研究取得了很大发展。2-苯乙醇微生物合成途径主要有3 条。其中，报道最多的是酵母菌以L-苯丙氨酸为唯一氮源，通过艾氏途径生产2-苯乙醇[25]。为提高酵母菌产2-苯乙醇产量，Etschmann等[6]用马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）CBS 600发酵41 h后获得2-苯乙醇0.89 g/L。徐峥等[26]用紫外诱变法选育酿酒酵母2-苯乙醇高产菌株，其2-苯乙醇产量达到3.55 g/L。汪琨等[27]优化酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CWY 132的培养条件后，其生产2-苯乙醇产量提高至4.1 g/L。田勋[20]经过对酿酒酵母细胞辅因子（NADH/NAD+）调控的研究，利用连续发酵85 h后积累获得2-苯乙醇15.1 g/L。黄筱萍等[28]利用S. cerevisiaeH003双罐连续补料发酵144 h后，通过原位产物分离技术获得2-苯乙醇产量达29.86 g/L。综上，增加2-苯乙醇产率的改进方式主要集中在合成途径、遗传修饰和代谢工程方面[29]。虽然酵母菌可通过艾氏途径从L-苯丙氨酸高效合成2-苯乙醇，但L-苯丙氨酸的添加提高了生产成本，因此限制了其工业生产规模。

从头合成途径产2-苯乙醇是以葡萄糖为唯一碳源，通过苯丙酮酸途径（即莽草酸途径）生成苯丙酮酸，苯丙酮酸再代谢为2-苯乙醇。苯丙酮酸途径可联系碳水化合物的代谢与芳香族化合物代谢，可直接由碳水化合物（例如葡萄糖）为底物代谢生产2-苯乙醇，无需添加L-苯丙氨酸，降低了生产成本[30]。目前报道通过该途径合成2-苯乙醇的菌种较少，仅有Zhang Haibo等[15]筛选到Enterobactersp. CGMCC5087可通过从头合成途径发酵24 h后，生成0.1 g/L 2-苯乙醇。本研究分离筛选获得了1 株具备从头合成途径和艾氏途径生产2-苯乙醇的菌株，且从头合成途径产2-苯乙醇产量是目前已报道的菌株的5 倍。通过菌种诱变筛选和基因工程改造方法可进一步提高Enterobactersp. MF024菌株从头合成途径的2-苯乙醇产量，降低成本，为天然2-苯乙醇的工业化生产奠定了基础。

3 结 论

本研究在环境土壤样品中分离筛选到1 株可生产2-苯乙醇且对2-苯乙醇有一定耐受能力的新菌株Enterobactersp. MF024。基因组序列分析表明该菌存在从头合成途径和艾氏途径的所有关键酶编码基因。2-苯乙醇生物转化实验进一步验证了Enterobactersp. MF024具备这两种2-苯乙醇合成途径，且2-苯乙醇产量分别达到0.56 g/L和1.15 g/L。研究为天然2-苯乙醇的工业生产提供了优良的出发菌株。